機械通氣所致急性肺損傷對大鼠晝夜節(jié)律改變和肺組織基因表達的影響.pdf

1、背景和目的
　　機械通氣肺損傷(ventilation-inducedlunginjury,VILI)是一種伴有細胞因子釋放的廣泛肺泡毛細血管膜的損傷,其發(fā)生率約占機械通氣的5％-39%。VILI的發(fā)生涉及到傳統(tǒng)的氣壓傷、容積傷、不張傷,以及生物性損傷。但VILI的發(fā)病機制復(fù)雜,迄今尚未完全闡明。目前很多報導(dǎo)指出肺腫瘤、慢性肺阻塞性疾病、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病以及缺血缺氧性腦損傷打破機體晝夜節(jié)律性而致病,運用時間療法能有效診治。VIL

2、I作為呼吸系統(tǒng)急性損傷,晝夜節(jié)律失衡亦可能是其發(fā)病機制之一。另外VILI是全身炎癥反應(yīng)的一部分,或是針對肺組織的特異反應(yīng),由多種細胞和因子參與,伴隨著多個基因和通路的表達。研究這些基因和通路,對于闡明VILI的發(fā)病機理具有重要意義?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了許多這方面的基因,但我們還需要在全基因組的水平上進行檢測,以全面研究VILI相關(guān)基因的表達?；蛐酒?genechip或DNAmicroarray)作為一種高通量、高效能的篩選工具,是研究基因表達的

3、有效方法。本研究采用全基因表達譜芯片技術(shù),篩選VILI大鼠差異表達基因,并分析這些基因的功能以及是否與晝夜節(jié)律相關(guān)基因關(guān)聯(lián),以進一步探討VILI發(fā)病的分子機制。
　　材料和方法
　　1VILI模型的制備以及晝夜節(jié)律變化的探討
　　72只SD大鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)(12h-day/12h-night)2周,將大鼠按照預(yù)進行通氣處理的四個時間點(1AM,7AM,1PM,7PM)隨機分為四個組,每組18只,每個時間點再隨機分為三組

4、(FB組n=6、LV組n=6、HV組n=6):FB組,自由呼吸組,不予機械通氣干預(yù);LV組,保護性機械通氣組,給予Vt8ml/Kg,PEEP0mmHg;HV組,大潮氣量通氣組,給與Vt40ml/Kg,PEEP0mmHg。共維持3h。監(jiān)測每只大鼠的平均動脈壓、心率、血氣變化。3h后放血處死大鼠,并留取標(biāo)本。HE染色觀察大鼠肺組織,并運用液相芯片技術(shù)檢測血漿促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、褪黑素(MT)水平。
　　2基因芯片技術(shù)篩選大鼠

5、VILI差異表達基因
　　選取1AM、1PM時間段FB組及HV組雄性大鼠,每組大鼠的不同時間段肺組織提取RNA,等量混合,采用Affymetrix公司的RatGenome2302.0Array,檢測大鼠的基因表達譜。在基因芯片結(jié)果中,選取Cyp1a1、Npas2、Nr1d13個差異基因,并對72只大鼠行RT-PCR,檢驗表達譜芯片的準(zhǔn)確性,并進一步探討VILI的分子機制。
　　3統(tǒng)計分析
　　實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x

6、±s)表示。基因芯片統(tǒng)計分析參照Affymetrix文件。其余統(tǒng)計分析應(yīng)用統(tǒng)計軟件SAS9.1進行統(tǒng)計分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。定量資料經(jīng)正態(tài)和方差齊性檢驗后,組間比較采用單因素方差分析(OneWayANOVA),多因素方差分析,組內(nèi)兩兩比較采用Tukey法進行。利用余弦節(jié)律函數(shù)F(t)=M+Acos(ωt+Φ)構(gòu)建模型并進行節(jié)律分析,P<0.05,說明模型擬合,節(jié)律存在且具有統(tǒng)計學(xué)意

7、義。Mesor代表余弦模型中的M值,Amplitude代表A值,通過A/M值判定,比值越高,說明節(jié)律性越強。
　　結(jié)果
　　1.動脈血壓、心率、MT組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,余弦分析無節(jié)律性,P>0.05。ACTH組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01。
　　2.動脈血氣變化,實驗前3組大鼠動脈血pH值、PaCO2和PaO2的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P>0.05;3h通氣處理后,HV組的PaCO2明顯降低,P<0.05。

8、>　　3.肺損傷評分,與FB組、LV組比較,HV組的肺損傷評分具有顯著的差異,P<0.01。
　　4.基因芯片檢查差異表達基因:HV組與FB組比較,共同差異基因56個,其中上調(diào)43個,下調(diào)13個。Il-6、Cox-2、Ccl2基因表達上調(diào)。對差異基因進行功能分類有以下幾種:a.炎癥相關(guān)基因,b.代謝相關(guān)基因,c.免疫相關(guān)基因,d.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因,e.其它如氧化抗氧化基因等。
　　5.RT-PCR檢測Cyp1a1、Npas2

9、、Nr1d1基因,與基因芯片表達趨勢相同。相對于FB組及LV組,HV組Nr1d1基因表達顯著下降,p<0.05。余弦分析Nr1d1基因在FB組具有節(jié)律性,P<0.05,余未見明顯節(jié)律性。
　　結(jié)論
　　1.本文成功地建立機械通氣肺損傷的大鼠在體模型(VILI),探討了機械通氣相關(guān)性肺損傷的病理生理改變及其可能原因與機制,為后續(xù)研究提供依據(jù)。
　　2.血漿ACTH水平在機械通氣中存在組間差異,本次實驗未見MT、ACTH存