低分子量PEI接枝大豆蛋白基因載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染性能研究.pdf

1、基因缺失和異常常導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，包括癌癥，心血管疾病，遺傳病等，這些疾病嚴重危害著人類的生命健康。基因治療作為一種新型的生物治療手段，因其能夠安全、準(zhǔn)確、有效的修正異變基因而備受關(guān)注。然而，如何設(shè)計適合的載體將目的基因高效、準(zhǔn)確地運載到靶細胞中仍然是目前研究的重點與難點。聚乙烯亞胺(PEI)是普遍應(yīng)用的陽離子聚合物基因載體之一，因其質(zhì)子化之后具有高的電荷密度和良好的質(zhì)子緩沖能力。其中，高枝化度后的PEI25 KDa和22 KDa擁有

2、高的轉(zhuǎn)染效率，因而被稱作聚陽離子基因載體領(lǐng)域中的“黃金準(zhǔn)則”。但是高分子量PEI細胞毒性大，生物降解能力差，易與血清蛋白結(jié)合等嚴重制約了其作為基因載體的應(yīng)用。另一方面，低分子量的PEI盡管細胞毒性弱，但是轉(zhuǎn)染效率低，有些甚至幾乎沒有轉(zhuǎn)染效率。為了解決低分子量PEI轉(zhuǎn)染效率低的問題，近年來研究人員對低分子量PEI進行了多方面的研究。
　　本論文基于天然大分子大豆分離蛋白為起始原料制備出一類簡單、可生物降解、高效的的聚陽離子基因載體。

3、首先對大豆分離蛋白進行酶解，接著離心和透析純化，得到具有良好水溶性的低分子量大豆蛋白(SP)。將不同低分子量的PEI(600Da，1200Da，1800Da)通過酰胺化反應(yīng)修飾在大豆蛋白上得到一系列大豆蛋白-PEI復(fù)合產(chǎn)物(SP-PEIs)，分別命名為SP-PEI600，SP-PEI1200，SP-PEI1800。經(jīng)過紅外和Zeta電位等實驗證實，不同低分子量PEI成功地接枝到大豆蛋白上。通過酸堿滴定實驗證明聚合物SP-PEIs的質(zhì)子緩

4、沖能力，通過蛋白吸附實驗檢測聚合物SP-PEIs對血清蛋白的抑制作用。接下來，復(fù)合物SP-PEIs/DNA的理化性質(zhì)得到進一步詳細研究。
　　聚合物與DNA形成的復(fù)合物具有理想的粒徑和電位有利于其快速進入細胞和提高基因轉(zhuǎn)染。在pH為7.4的生理條件下，SP-PEIs與DNA形成的復(fù)合物隨著N/P質(zhì)量比的增加，復(fù)合物的粒徑逐漸發(fā)生改變，最終會穩(wěn)定在100-200nm左右，復(fù)合物SP-PEIs/DNA的電位也是隨著N/P質(zhì)量比的增大而

5、增長。檢測不同pH下復(fù)合物SP-PEIs/DNA粒徑的變化，發(fā)現(xiàn)其在生理條件下(pH=7.4)可以穩(wěn)定存在，在酸性條件下粒徑發(fā)生明顯變化，該特性有助于復(fù)合物上中的DNA從內(nèi)涵體中逃逸出來。另外，通過瓊脂糖電泳實驗檢測聚合物SP-PEIs對DNA的壓縮能力，DNaseⅠ降解實驗和肝素置換實驗則進一步檢測聚合物對DNA的壓縮能力。
　　之后，通過一系列細胞實驗進一步評估了聚合物SP-PEIs作為基因載體的潛力和優(yōu)勢。枝化的PEI25K

6、Da作為對照組，體外細胞毒性實驗表明，在人腎上皮細胞(293T)、人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)共培養(yǎng)中，聚合物SP-PEIs均表現(xiàn)出比對照組PEI25 KDa更低的毒性及良好的生物相容性。利用流式細胞儀和熒光倒置顯微鏡檢測SP-PEIs/DNA復(fù)合物在有血清和無血清環(huán)境下的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果證明，無論在有血清和無血清條件下復(fù)合物SP-PEIs/DNA在SH-SY5Y細胞系均有較高的轉(zhuǎn)染效率。特別是聚合物SP-PEI1800與DNA在

7、質(zhì)量比為24時，無血清條件下轉(zhuǎn)染效率(5.27％)是對照組(1.94％)的2.7倍，在有血清條件下則高達3.4倍;而在293T細胞中，無血清條件下聚合物SP-PEI1800與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為24的時候最高轉(zhuǎn)染效率(15.1％)和對照組的轉(zhuǎn)染效率(16.6％)幾乎相當(dāng);同樣的在有血清狀態(tài)下，聚合物SP-PEI1800(8.19％)也能取得和對照組類似的轉(zhuǎn)染效率(7.22％)。
　　本論文制備的復(fù)合物SP-PEIs作為新型的基因載體