小麥低分子量麥谷蛋白基因XYGluD3-LMWGSI的原核表達(dá)體系的構(gòu)建.pdf

1、小麥面團(tuán)的特性被高、低分子量麥谷蛋白亞基通過分子間二硫鍵形成的麥谷蛋白大聚合體(GMP)的含量、組成和粒度分布所影響。因此，占小麥面筋蛋白總量40％的低分子量麥谷蛋白亞基與面粉加工品質(zhì)有密切聯(lián)系。登錄號為AY263369的XYGluD3-LMWGSI，是在小麥中首次發(fā)現(xiàn)的編碼九個半胱氨酸殘基的小麥低分子量麥谷蛋白亞基，推測該優(yōu)質(zhì)基因比普通LMW-GS多一個半胱氨酸的特性對面粉品質(zhì)有重要影響。為進(jìn)一步深入了解其功能，本實驗對該基因進(jìn)行了真

2、核與原核的載體構(gòu)建，并嘗試了利用SUMO標(biāo)簽增強原核可溶性表達(dá)的探索性研究。 方法：利用PCR方法從已有質(zhì)粒XYGluD3-LMWGSI/pGEM-Teasy中克隆到小麥D位點低分子量麥谷蛋白(XYGluD3-LMWGSI)亞基全長1562bp(包含上游啟動子)和XYGluD3-LMWGSI-noP 798bp(不含上游啟動子，簡稱LnoP)，分別構(gòu)建真核表達(dá)載體XYGluD3-LMWGS-GFP/PBll21和原核表達(dá)載體Ln

3、oP/pGEX-4T-1。并借助質(zhì)粒SUMO1/pET-4la(+)構(gòu)建原核表達(dá)載體LnoP-SUMO1/pET-41a(+)(Lsl/pET41)與LnoP-SUMO1-N2/pET-41a(+)(LnoPS-N2/pET41)以及LnoP-SUMO1/pET-32a(+)(LSl/pET32)。將原核表達(dá)載體LnoP/pGEX-4T-1、Lsl/pET41a和LnoPS-N2/pET41，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中

4、，LS1/pET32轉(zhuǎn)化到OrigamiB菌株中，IPTG(1mmo/L)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST-LnoP、GST-SUMO1-LnoP、SUMO1-LnoP和Trx-SUMO1-LnoP。凝膠電泳和Western blot分析GST-LnoP、GST-SUMO1-LnoP、SUMO1-LnoP以及Trx-SUMO1-LnoP的可溶性。利用冬小麥栽培品種綿陽19的幼胚愈傷為受體材料，嘗試進(jìn)行了XYGluD3-LMWGS-GFP/PBI1

5、21的基因槍轉(zhuǎn)化。 結(jié)果： 1、成功構(gòu)建原核表達(dá)載體LnoP/pGEX-4T-1、LnoP-SUMO1/pET-41a(+)(Lsl/pET41)、LnoPSUM01-N2/pET-41a(+)(LnoPS-N2/pET41)、LnoP-SUMO1/pET-32a(+)(LS1/pET32)與真核表達(dá)載體XYGIuD3-LMWGS-GFP/PBI121(簡稱LG/PBI121)。 2、IPTG誘導(dǎo)融合蛋白GST-

6、LnoP、GST-SUMO1-LnoP、SUMO1-LnoP和Trx-SUMO1-LnoP表達(dá)成功。電泳和Westem blot分析GST-LnoP，為包涵體表達(dá)，嘗試復(fù)性GST-LnoP，仍不能上柱純化，要獲得純LnoP蛋白僅能凝血酶酶切切膠回收。GST-SUMO1-LnoP的可溶表達(dá)亦為電泳不可見，SUMO1-LnoP與Trx-SUMO1-LnoP有微量可溶表達(dá)，但仍然說明人SUMO1標(biāo)簽對于增加小麥低分子量D位點亞基可溶性的作用并