四倍體小麥醇溶蛋白和低分子量谷蛋白基因序列分析.pdf

1、根據(jù)已發(fā)表的α-醇溶蛋白基因和LMW-GS基因的序列保守性，分別設(shè)計(jì)了特異引物對野生二粒小麥、阿拉拉特小麥、提莫菲維小麥的α-醇溶蛋白基因和低分子量谷蛋白基因完整編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物回收、克隆、測序和分析。主要結(jié)果如下： 1.從野生二粒小麥材料As842中獲得4個α-醇溶蛋白基因序列GliTd-1、GliTd-2、GliTd-3和GliTd-4，GenBank登錄號分別為DQ140349、DQ140350、DQ14035

2、1和DQ140352。其中，GliTd-3和GliTd-4編碼區(qū)長度均為861bp，編碼由267個氨基酸殘基組成的蛋白，其中信號肽包含19個氨基酸殘基；而GliTd-1和GliTd-2編碼區(qū)分別長821bp和859bp，由于編碼區(qū)內(nèi)存在提前終止密碼子和插入/缺失引起的移碼突變，推測其為不表達(dá)的假基因。基于通用密碼子，估算GliTd-3和GliTd-4編碼的成熟蛋白的相對分子量分別為30.85和30.87kD。序列比對顯示，這4個基因與已

3、報(bào)道的α-醇溶蛋白基因一致性較高；蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中有6個保守的半胱氨酸；重復(fù)區(qū)的重復(fù)單元與已知基因有區(qū)別；成熟蛋白N末端前60個氨基酸組成的序列對乳糜瀉病人毒性更大；脯氨酸密碼子的使用有明顯的偏好；谷氨酰胺在整個蛋白中含量豐富，但在特定的區(qū)域呈現(xiàn)集中分布的特點(diǎn)。 2.從野生二粒小麥材料As842中獲得3個LMW-GS基因序列LMW-Td1、LMW-Td2和LMW-Td3。LMW-Td1的GenBank登錄號為AY748826。其

4、中，LMW-Td1和LMW-Td3編碼區(qū)長度分別為858bp和1062bp，可分別編碼包含284個和352個氨基酸殘基的成熟蛋白；LMW-Td2編碼區(qū)長900bp，由于編碼區(qū)內(nèi)存在3個提前終止密碼子，推測其為不表達(dá)的假基因。根據(jù)LMW-Td1和LMW-Td3的氨基酸序列估算的分子量分別為32kD和40kD。根據(jù)N-木端氨基酸序列，可將LMWD-1、LMWD-2和LMWD-3歸為LMW-m型LMW-GS基因。 序列比對顯示，LMW

5、-Td1與所有已知的LMW-GS基因有明顯的不同，是一種新類型。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明LMW-Td1和LMW-Td2與位于1A染色體的LMW-GS基因類似，而LMW-Td3與位于1B的基因相似性更高。 3.從阿拉拉特小麥材料CItr17677中獲得4個α-醇溶蛋白完整基因和6個基因片段，并分別以GliTa-1至GliTa-10的編號命名。其中，只有Gli-Ta1和Gli-Ta5中沒有提前終止密碼子和移碼突變，而其它基因序列均存在提前終

6、止密碼子或移碼突變，因此推測其它序列可能是不能正常表達(dá)的假基因。對10條阿拉拉特小麥、4條野生二粒小麥和5條六倍體小麥α-醇溶蛋白基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)特定位點(diǎn)的密碼子CAG更容易發(fā)生無義突變。α-醇溶蛋白密碼子第一位偏好使用GC，第二和第三位AT含量較高，已分析的α-醇溶蛋白基因偏好使用AT。阿拉拉特小麥、野生二粒小麥和六倍體小麥α-醇溶蛋白基因密碼子使用模式?jīng)]有明顯差異。 4.從阿拉拉特小麥材料CItr17677中獲得2個L

7、MW-GS基因序列LMW-Ta1和LMW-Ta2，全長均為1167bp，編碼387個氨基酸，它們之間的差異僅是第524位堿基A突變?yōu)镚，導(dǎo)致谷氨酰胺被精氨酸代替。根據(jù)通用三聯(lián)體密碼推導(dǎo)的氨基酸序列顯示LMW-Ta1和LMW-Ta2具有單一完整的開放閱讀框，估計(jì)的分子量是44.6和44.5kD，所以應(yīng)為B型亞基。根據(jù)N-末端氨基酸序列，可將LMW-Ta1和LMW-Ta2歸為LMW-i型LMW-GS基因。氨基酸序列比對顯示，LMW-Ta1和

8、LMW-Ta2與位于Glu-A3位點(diǎn)的第1類LMW-GS基因的序列具有最高的一致性，不同基因的區(qū)別主要是重復(fù)區(qū)長度不同。 5.從提莫菲維小麥材料PI341802中得到1個α-醇溶蛋白全基因(GliTt-1)和4個基因片段(GliTt-2，GliTt-3，GliTt-4和GliTd-5)。其中，Gli-Tt1序列全長855bp，可編碼284個氨基酸，推測的分子量是32.6kD；Gli-Tt2和Gli-Tt3全長807bp，編碼26

9、8個氨基酸；Gli-Tt4全長846bp，編碼第170、228、235和239位氨基酸的密碼子發(fā)生了無義突變；Gli-Tt5全長762bp，編碼第16、21、93、154和218位氨基酸的密碼子被終止密碼子取代，3’末端CCCC區(qū)域發(fā)生了1個C的丟失，引起移碼突變。提莫菲維小麥α-醇溶蛋白基因的密碼子使用模式與阿拉拉特小麥、野生二粒小麥和六倍體小麥相似。發(fā)生無義突變的密碼子種類及分布也與阿拉拉特小麥相似。這進(jìn)一步印證了阿拉拉特小麥和提莫

10、菲維小麥相近的親緣關(guān)系。 6.從提莫菲維小麥材料PI341802中得到2條LMW-GS基因序列LMW-Tt1和LMW-Tt2。LMW-Tt1和LMW-Tt2的核苷酸序列分別為1170和888bp，分別編碼388和294個氨基酸殘基，成熟蛋白中分別有368和274個氨基酸。根據(jù)LMW-Tt1編碼區(qū)氨基酸序列估算的分子量介于40-50kD，所以應(yīng)歸為B型亞基；LMW-Tt2的分子量約為30-40kD，因此屬于C型亞基。LMW-Tt1