基于轉糖基功能的右旋糖酐蔗糖酶分子改造、表達及催化性能的研究.pdf

1、糖基轉移酶(Glycosyltransferase，GT,EC2.4.x.y)的轉糖基作用是催化葡萄糖基轉移到受體分子上，使受體分子糖基化，形成糖基化衍生物包括非天然糖類化合物和功能性低聚糖等。非天然糖類化合物可以改變原來天然化合物的理化性質，功能性低聚糖作為調節(jié)腸道平衡的雙歧因子應用在醫(yī)藥、食品、保健品等領域。本論文通過分子學手段對右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase，DSR)進行改造，構建篩選得到具較高活性的突出轉糖基的DS

2、R突變酶，揭示其轉糖基功能的關鍵區(qū)域;并對該突變酶的性質進行研究，同時利用改造后的轉糖基酶對不同糖類受體和維生素C(VC)進行糖基化，與原始酶進行分析比較，獲得該突變酶對受體糖基化的催化規(guī)律。
　　首先通過分子截短方法，截短右旋糖蔗糖酶的C-端1494bp片段，得到剩余1-3087bp基因片段的DSR-S1-ΔA突變酶，并對突變酶的表達條件進行優(yōu)化。酶學性質研究發(fā)現(xiàn):該酶最適pH均為5.4，pH穩(wěn)定性均為4.4-7;最適溫度均為2

3、5℃;DSR-S1-ΔA酶在沒有受體情況下，酶活完全喪失;受體存在時，DSR-S1-ΔA酶活是原始酶酶活的71.4％，其中糖基轉移活性是水解活性的5.3倍，DSR-S1-ΔA耐熱性比原始酶有所下降，在30℃保藏1h酶活力只有20.8％。以麥芽糖為受體研究表明，受體濃度為200mM時酶活最高，供體蔗糖對DSR-S1-ΔA酶的影響較大，酶活隨著蔗糖濃度提高而不斷增加。結果顯示DSR-S1-ΔA主要活性為轉糖基功能，多糖聚合能力低，從而明確了

4、DSR的轉糖基功能區(qū)域。
　　通過對麥芽糖、纖維二糖、棉子糖和水蘇糖等不同糖類受體的轉糖基研究，結果表明:麥芽糖是該酶轉糖基反應的最佳受體，同時對纖維二糖、棉子三糖和水蘇糖都有活性，但轉糖基依次減弱;不同天然低聚糖的轉糖基反應都趨向于生成低分子量的糖，轉移1-2個葡萄糖基到受體分子，并且受體分子量越小越易進行轉糖基作用，α鍵連接糖類化合物比β鍵連接糖類化合物更易進行轉糖基反應;說明改造后的酶能利用更少的麥芽糖合成更多的低聚糖。論文