脂肪酶選擇性催化合成蘆丁脂肪酸酯及物化性質.pdf

1、黃酮類化合物(flavonoids)廣泛分布于綠色植物中，具有抗衰老、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、免疫調節(jié)等多種生物活性，在保健食品、化妝品和藥劑配置等領域有很大的應用前景。然而黃酮類化合物在自然界多以糖苷的形式存在，糖苷極性大，具有一定的親水性，它與脂肪和油類的相容性很差，難以在脂肪類溶劑中穩(wěn)定存在，這就限制了黃酮類化合物在這些領域的應用。據研究黃酮類化合物的各種生物活性都是以抗氧化活性為基礎的，與抗自由基或抗脂質過氧化有關。特殊的結構賦予

2、它一系列獨特的化學性質，如能與多種金屬離子發(fā)生絡合或靜電作用，具有還原和捕獲自由基的特性以及諸多衍生化反應活性等。黃酮類化合物抑制低密度脂蛋白LDL氧化和抑制類胡蘿卜素及不飽和脂肪酸氧化的研究表明，苷元比糖苷具有更優(yōu)秀的抗氧化活性。這是由于苷元親脂性強，能嵌入生物膜疏水層的內核中發(fā)揮作用。黃酮苷類化合物的多羥基及糖基結構使其具有一定的親水性，這勢必會影響抗氧化活性。黃酮類化合物通過酯化修飾，在分子中引入長烴鏈可以增加它的脂溶性，從而增加

3、和脂肪的相容性及提高抗氧化性。然而通常的化學修飾反應選擇性差，黃酮類化合物的多個羥基都有可能參與酯化，往往結合或屏蔽了主要活性基團，雖然增加了其脂溶性，但降低了本身的抗氧化效果。因此，化學修飾酯化反應通常要經“基團保護-酯化-脫保護基團”三步。酶催化反應具有較強的專一性與選擇性，可以選擇酯化黃酮類化合物的某位羥基。到目前為止，黃酮苷在酶催化下的酯化已有比較詳細的研究，但反應中分子篩添加時間的不同對酯化反應的影響還未見有文獻報道。目前引入

4、黃酮苷分子中的最長烴基鏈也只有16個碳長度，烴鏈進一步增長可能賦予酯化產物新的性質，比如兩親性。正是基于這些原因，本文以硬脂酸、月桂酸和正己酸為酰基供體，以脂肪酶Novozym 435為催化劑對蘆丁進行選擇性酯化，合成并提純出了三種含不同烴基鏈長度的蘆丁脂肪酸酯。用紅外光譜和核磁共振波譜對其進行結構鑒定，結果表明該類酯化物的酯化反應位為鼠李糖的C4"'位羥基。以高效液相色譜監(jiān)測酯化反應進程，首次研究了分子篩添加時間不同對酯化率的影響。本

5、實驗首次得到了蘆丁脂肪酸酯的紫外-可見光譜，蘆丁脂肪酸酯在256 nm和357 nm有特征吸收。生物分子的吸收代謝涉及它們和生物膜的相互作用，生物膜的結構形態(tài)和生理性質如通透性、流動性等隨之發(fā)生變化。黃酮類化合物和脂質體雙層膜相互作用的研究比較多，很少有和單分子膜相互作用的報道。磷脂單分子膜通常作為生物膜的簡化體系，研究黃酮類化合物和磷脂單分子膜的相互作用可以從分子水平上揭示黃酮類化合物的抗氧化機理。但是黃酮類化合物的分子為多苯環(huán)排列的

6、平面結構，不能在氣/液界面鋪展，因此以黃酮類化合物為模型物的單分子膜研究很少。然而通過酯化將長碳鏈引入黃酮類化合物分子中，這將賦予它兩親性。本文合成的蘆丁硬脂酸酯(RS)，蘆丁月桂酸酯(RL)和蘆丁正己酸酯(RC)具有兩親分子的特征，親水基為帶蕓香糖和多個酚羥基的蘆丁母核，疏水基為多碳烴基鏈，分子具有兩親性而且水溶性很低，能在空氣/水界面鋪展為單分子膜，可以作為一種研究單分子膜的新型模型分子。而且蘆丁脂肪酸酯單獨成膜性質的研究能夠為它和

7、生物膜相互作用的研究打下基礎。 本文用LB膜分析儀研究了RS、RL和RC在空氣/水界面的成膜特性，及亞相中的Al<'3+>對其成膜性質的影響，為進一步研究它們和磷脂單分子膜的相互作用打下基礎。研究結果表明蘆丁脂肪酸酯的成膜性與引入的碳鏈長度、壓膜速度和亞相性質有關。RS及RL在空氣/水界面都鋪展為液態(tài)擴張單分子膜，它們在水面的形態(tài)為苷元部分保留在空氣/水界面，蕓香糖的兩個糖基緊密排列于水面下，疏水鏈松散地伸向空氣中。RS能鋪展成

8、較RL穩(wěn)定的單分子膜。但相對于龐大的親水基，兩者引入的碳鏈較短，均不能在水面形成足夠穩(wěn)定的單分子膜。RC在水中有很大的溶解度，不能在水表面形成單分子膜。在Al<'3+>的水溶液表面，由于親水基與Al<'3+>絡合，使更多的蘆丁脂肪酸酯分子能夠保留在亞相表面，因此RS、RL在崩潰壓時的平均分子面積較亞相為水時大；而RC也能在表面形成液態(tài)擴張膜。本文合成的蘆丁脂肪酸酯是一類新型兩親分子，根據其在水面Langmuir單分子膜的研究發(fā)現，雖然蘆

9、丁脂肪酸酯的疏水性很強，能在水面鋪展為單分子膜，但它在水中仍有一定的溶解度，盡管非常低。研究蘆丁脂肪酸酯在溶液表面的吸附特性，可以作為其鋪展單分子膜(解吸過程)的補充和對照。而且至今還未見研究蘆丁脂肪酸酯吸附單分子膜的文獻。本文在研究蘆丁脂肪酸酯的吸附膜過程中發(fā)現它在水中的溶解度極低，1000 ml水中還不能溶解1 mg蘆丁脂肪酸酯。如此低的濃度，再加上表面張力儀的測量誤差，最終很可能測出的表面張力值和純水的幾乎相等。蘆丁脂肪酸酯在堿水

10、溶液中的溶解度比水中大，但蘆丁在pH>8.77的情況下會電離形成鈉鹽，因此，本文將三種烴基鏈長的蘆丁脂肪酸酯溶解在很稀的NaOH水溶液(pH≈8)中，確保它們既能以一定濃度溶解又不會發(fā)生電離成鹽。用Wilhelmy吊片法測蘆丁脂肪酸酯溶液的表面張力，并用研究吸附膜的常規(guī)方法討論了吸附過程的一些性質。三種蘆丁脂肪酸酯堿水溶液的表面張力都隨溶液濃度的增加而降低。它們的表面性質和含有的疏水鏈長度有關，疏水鏈越長降低堿水溶液表面張力的能力越強，

11、CMC值大。 生物膜中含有很多飽和及不飽和的脂肪酸，黃酮類化合物的抗氧化活性部分體現在它和脂肪酸的相互作用方面。由混合單分子膜的π-A曲線可得到單分子膜的崩潰壓、平均分子面積、超額自由能、可壓縮性等信息，它們不僅反映成膜性質，還能提供成膜分子間的相互作用力等微觀信息。硬脂酸通常都作為研究混合單分子膜的一種重要組分?；谶@些原因，本文用LB膜分析儀對能在水面鋪展成單分子膜的RS及RL與硬脂酸混合單分子膜在不同摩爾配比不同膜壓下的相

12、容性、熱力學穩(wěn)定性、膜收縮/膨脹性和壓縮性等成膜性質作了研究。研究結果表明，在任何摩爾配比和膜壓下兩種混合體系中的組分都相容。SA的加入使膜壓縮性發(fā)生的變化與膜壓及SA的摩爾含量都有關。對于RS/SA混合膜體系，隨SA摩爾含量增大，膜分子間作用力由吸引力逐漸變?yōu)榕懦饬?，組分間的相容性變差。在各種膜壓下，X<,SA>=0.167附近膜收縮效應最大，能形成最穩(wěn)定的混合膜。膜壓越小SA對混合膜的收縮或膨脹效果越顯著。對于RL/SA混合單分子膜

13、，膜分子間作用力始終為排斥力，膜呈膨脹狀態(tài)，混合體系不穩(wěn)定。RS的碳鏈長，并且具有和SA相同的疏水鏈碳數，因此RS/SA較RL/SA混合膜體系的相容性和穩(wěn)定性好。脂質的氧化通常是自由基進攻含不飽和鍵的磷脂，因此研究黃酮類化合物與含不飽和鍵磷脂的相互作用是非常有意義的?；谶@些原因，本文選擇L-α二油酸磷脂酰膽堿(DOPC)單分子膜為生物膜的簡化體系，用LB膜分析儀討論了它和RS及RL混合單分子膜的組分相容性、熱力學穩(wěn)定性和膜壓縮性，并得

14、到了膜分子間相互作用的相關信息。這些信息對從分子水平上解釋蘆丁脂肪酸酯對磷脂膜的抗氧化機理是非常有價值的。不同溫度下磷脂的存在狀態(tài)不同，這必然導致混合單分子膜某些性質發(fā)生改變，同時會影響分子間相互作用。因此本文還討論了溫度對DOPC/蘆丁脂肪酸酯混合單分子膜的成膜性質。任何溫度和任何混合比例下的DOPC/RS和DOPC/RL混合單分子膜中的兩組分是完全互容的。溫度越高組分相容性越好。在各種溫度下，RS對DOPC單分子膜的收縮效果隨表面壓

15、降低而更加顯著。RS對DOPC單分子膜的收縮作用是由于兩種分子形狀匹配，可以以相互咬合的方式排列。DOPC與RL的相容性比較差，這是由于RL的烴鏈短，在某些條件下兩組分的分子結構不匹配。但升溫或降低RL含量都能改善兩組分的相容性。DOPC/RS混合體系在三個實驗溫度的某些條件下都是熱力學穩(wěn)定的，而DOPC/RL體系只有在37℃時才在0.2<0.5范圍內處于熱力學穩(wěn)定狀態(tài)。溫度對DOPC/RS和DOPC/RL混合單分子膜的C

16、<,s>沒有影響。任何溫度下，混合單分子膜中蘆丁脂肪酸酯的摩爾含量越大膜越容易被壓縮，且C<,s>隨膜壓的增大而減小。 蘆丁是一類重要的黃酮類化合物，通過酶催化酯化引入長烴基鏈得到的蘆丁脂肪酸酯具有較強的脂溶性，由此推測它在脂類中的抗氧化性將增強。然而至今國內外還未見有關黃酮糖苷脂肪酸酯的抗氧化性研究。本文以反映脂質氧化修飾程度的硫代巴比妥酸反應物質(TBARS)為指標，研究了含不同長度烴鏈的RS、RL和RC對Fe<'2+>介導

17、的卵磷脂氧化修飾的影響。結果表明蘆丁脂肪酸酯的抗氧化活性優(yōu)于蘆丁。而且RC具有最好的抗氧化活性，能使氧化體系中卵磷脂的MDA含量在四小時內都保持非常低。黃酮類化合物在人體內主要通過體液吸收代謝，而RS、RL及RC在水中的溶解度非常小，這將影響它們的抗氧化效果。本文以蘆丁月桂酸酯(RL)為代表，自制了RL-聚乙二醇固體分散體。結果表明以PEG4000為載體，采用甲醇溶解法制備RL為固體分散體，可以顯著提高RL的溶解度，并起到緩釋RL的效果