脂肪酶選擇性催化合成蘆丁脂肪酸酯及物化性質(zhì).pdf

1、黃酮類(lèi)化合物(flavonoids)廣泛分布于綠色植物中，具有抗衰老、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，在保健食品、化妝品和藥劑配置等領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景。然而黃酮類(lèi)化合物在自然界多以糖苷的形式存在，糖苷極性大，具有一定的親水性，它與脂肪和油類(lèi)的相容性很差，難以在脂肪類(lèi)溶劑中穩(wěn)定存在，這就限制了黃酮類(lèi)化合物在這些領(lǐng)域的應(yīng)用。據(jù)研究黃酮類(lèi)化合物的各種生物活性都是以抗氧化活性為基礎(chǔ)的，與抗自由基或抗脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。特殊的結(jié)構(gòu)賦予

2、它一系列獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，如能與多種金屬離子發(fā)生絡(luò)合或靜電作用，具有還原和捕獲自由基的特性以及諸多衍生化反應(yīng)活性等。黃酮類(lèi)化合物抑制低密度脂蛋白LDL氧化和抑制類(lèi)胡蘿卜素及不飽和脂肪酸氧化的研究表明，苷元比糖苷具有更優(yōu)秀的抗氧化活性。這是由于苷元親脂性強(qiáng)，能嵌入生物膜疏水層的內(nèi)核中發(fā)揮作用。黃酮苷類(lèi)化合物的多羥基及糖基結(jié)構(gòu)使其具有一定的親水性，這勢(shì)必會(huì)影響抗氧化活性。黃酮類(lèi)化合物通過(guò)酯化修飾，在分子中引入長(zhǎng)烴鏈可以增加它的脂溶性，從而增加

3、和脂肪的相容性及提高抗氧化性。然而通常的化學(xué)修飾反應(yīng)選擇性差，黃酮類(lèi)化合物的多個(gè)羥基都有可能參與酯化，往往結(jié)合或屏蔽了主要活性基團(tuán)，雖然增加了其脂溶性，但降低了本身的抗氧化效果。因此，化學(xué)修飾酯化反應(yīng)通常要經(jīng)“基團(tuán)保護(hù)-酯化-脫保護(hù)基團(tuán)”三步。酶催化反應(yīng)具有較強(qiáng)的專(zhuān)一性與選擇性，可以選擇酯化黃酮類(lèi)化合物的某位羥基。到目前為止，黃酮苷在酶催化下的酯化已有比較詳細(xì)的研究，但反應(yīng)中分子篩添加時(shí)間的不同對(duì)酯化反應(yīng)的影響還未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。目前引入

4、黃酮苷分子中的最長(zhǎng)烴基鏈也只有16個(gè)碳長(zhǎng)度，烴鏈進(jìn)一步增長(zhǎng)可能賦予酯化產(chǎn)物新的性質(zhì)，比如兩親性。正是基于這些原因，本文以硬脂酸、月桂酸和正己酸為?；w，以脂肪酶Novozym 435為催化劑對(duì)蘆丁進(jìn)行選擇性酯化，合成并提純出了三種含不同烴基鏈長(zhǎng)度的蘆丁脂肪酸酯。用紅外光譜和核磁共振波譜對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果表明該類(lèi)酯化物的酯化反應(yīng)位為鼠李糖的C4"'位羥基。以高效液相色譜監(jiān)測(cè)酯化反應(yīng)進(jìn)程，首次研究了分子篩添加時(shí)間不同對(duì)酯化率的影響。本

5、實(shí)驗(yàn)首次得到了蘆丁脂肪酸酯的紫外-可見(jiàn)光譜，蘆丁脂肪酸酯在256 nm和357 nm有特征吸收。生物分子的吸收代謝涉及它們和生物膜的相互作用，生物膜的結(jié)構(gòu)形態(tài)和生理性質(zhì)如通透性、流動(dòng)性等隨之發(fā)生變化。黃酮類(lèi)化合物和脂質(zhì)體雙層膜相互作用的研究比較多，很少有和單分子膜相互作用的報(bào)道。磷脂單分子膜通常作為生物膜的簡(jiǎn)化體系，研究黃酮類(lèi)化合物和磷脂單分子膜的相互作用可以從分子水平上揭示黃酮類(lèi)化合物的抗氧化機(jī)理。但是黃酮類(lèi)化合物的分子為多苯環(huán)排列的

6、平面結(jié)構(gòu)，不能在氣/液界面鋪展，因此以黃酮類(lèi)化合物為模型物的單分子膜研究很少。然而通過(guò)酯化將長(zhǎng)碳鏈引入黃酮類(lèi)化合物分子中，這將賦予它兩親性。本文合成的蘆丁硬脂酸酯(RS)，蘆丁月桂酸酯(RL)和蘆丁正己酸酯(RC)具有兩親分子的特征，親水基為帶蕓香糖和多個(gè)酚羥基的蘆丁母核，疏水基為多碳烴基鏈，分子具有兩親性而且水溶性很低，能在空氣/水界面鋪展為單分子膜，可以作為一種研究單分子膜的新型模型分子。而且蘆丁脂肪酸酯單獨(dú)成膜性質(zhì)的研究能夠?yàn)樗?/p>

7、生物膜相互作用的研究打下基礎(chǔ)。 本文用LB膜分析儀研究了RS、RL和RC在空氣/水界面的成膜特性，及亞相中的Al<'3+>對(duì)其成膜性質(zhì)的影響，為進(jìn)一步研究它們和磷脂單分子膜的相互作用打下基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明蘆丁脂肪酸酯的成膜性與引入的碳鏈長(zhǎng)度、壓膜速度和亞相性質(zhì)有關(guān)。RS及RL在空氣/水界面都鋪展為液態(tài)擴(kuò)張單分子膜，它們?cè)谒娴男螒B(tài)為苷元部分保留在空氣/水界面，蕓香糖的兩個(gè)糖基緊密排列于水面下，疏水鏈松散地伸向空氣中。RS能鋪展成

8、較RL穩(wěn)定的單分子膜。但相對(duì)于龐大的親水基，兩者引入的碳鏈較短，均不能在水面形成足夠穩(wěn)定的單分子膜。RC在水中有很大的溶解度，不能在水表面形成單分子膜。在Al<'3+>的水溶液表面，由于親水基與Al<'3+>絡(luò)合，使更多的蘆丁脂肪酸酯分子能夠保留在亞相表面，因此RS、RL在崩潰壓時(shí)的平均分子面積較亞相為水時(shí)大；而RC也能在表面形成液態(tài)擴(kuò)張膜。本文合成的蘆丁脂肪酸酯是一類(lèi)新型兩親分子，根據(jù)其在水面Langmuir單分子膜的研究發(fā)現(xiàn)，雖然蘆

9、丁脂肪酸酯的疏水性很強(qiáng)，能在水面鋪展為單分子膜，但它在水中仍有一定的溶解度，盡管非常低。研究蘆丁脂肪酸酯在溶液表面的吸附特性，可以作為其鋪展單分子膜(解吸過(guò)程)的補(bǔ)充和對(duì)照。而且至今還未見(jiàn)研究蘆丁脂肪酸酯吸附單分子膜的文獻(xiàn)。本文在研究蘆丁脂肪酸酯的吸附膜過(guò)程中發(fā)現(xiàn)它在水中的溶解度極低，1000 ml水中還不能溶解1 mg蘆丁脂肪酸酯。如此低的濃度，再加上表面張力儀的測(cè)量誤差，最終很可能測(cè)出的表面張力值和純水的幾乎相等。蘆丁脂肪酸酯在堿水

10、溶液中的溶解度比水中大，但蘆丁在pH>8.77的情況下會(huì)電離形成鈉鹽，因此，本文將三種烴基鏈長(zhǎng)的蘆丁脂肪酸酯溶解在很稀的NaOH水溶液(pH≈8)中，確保它們既能以一定濃度溶解又不會(huì)發(fā)生電離成鹽。用Wilhelmy吊片法測(cè)蘆丁脂肪酸酯溶液的表面張力，并用研究吸附膜的常規(guī)方法討論了吸附過(guò)程的一些性質(zhì)。三種蘆丁脂肪酸酯堿水溶液的表面張力都隨溶液濃度的增加而降低。它們的表面性質(zhì)和含有的疏水鏈長(zhǎng)度有關(guān)，疏水鏈越長(zhǎng)降低堿水溶液表面張力的能力越強(qiáng)，

11、CMC值大。 生物膜中含有很多飽和及不飽和的脂肪酸，黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性部分體現(xiàn)在它和脂肪酸的相互作用方面。由混合單分子膜的π-A曲線(xiàn)可得到單分子膜的崩潰壓、平均分子面積、超額自由能、可壓縮性等信息，它們不僅反映成膜性質(zhì)，還能提供成膜分子間的相互作用力等微觀信息。硬脂酸通常都作為研究混合單分子膜的一種重要組分?；谶@些原因，本文用LB膜分析儀對(duì)能在水面鋪展成單分子膜的RS及RL與硬脂酸混合單分子膜在不同摩爾配比不同膜壓下的相

12、容性、熱力學(xué)穩(wěn)定性、膜收縮/膨脹性和壓縮性等成膜性質(zhì)作了研究。研究結(jié)果表明，在任何摩爾配比和膜壓下兩種混合體系中的組分都相容。SA的加入使膜壓縮性發(fā)生的變化與膜壓及SA的摩爾含量都有關(guān)。對(duì)于RS/SA混合膜體系，隨SA摩爾含量增大，膜分子間作用力由吸引力逐漸變?yōu)榕懦饬?，組分間的相容性變差。在各種膜壓下，X<,SA>=0.167附近膜收縮效應(yīng)最大，能形成最穩(wěn)定的混合膜。膜壓越小SA對(duì)混合膜的收縮或膨脹效果越顯著。對(duì)于RL/SA混合單分子膜

13、，膜分子間作用力始終為排斥力，膜呈膨脹狀態(tài)，混合體系不穩(wěn)定。RS的碳鏈長(zhǎng)，并且具有和SA相同的疏水鏈碳數(shù)，因此RS/SA較RL/SA混合膜體系的相容性和穩(wěn)定性好。脂質(zhì)的氧化通常是自由基進(jìn)攻含不飽和鍵的磷脂，因此研究黃酮類(lèi)化合物與含不飽和鍵磷脂的相互作用是非常有意義的?；谶@些原因，本文選擇L-α二油酸磷脂酰膽堿(DOPC)單分子膜為生物膜的簡(jiǎn)化體系，用LB膜分析儀討論了它和RS及RL混合單分子膜的組分相容性、熱力學(xué)穩(wěn)定性和膜壓縮性，并得

14、到了膜分子間相互作用的相關(guān)信息。這些信息對(duì)從分子水平上解釋蘆丁脂肪酸酯對(duì)磷脂膜的抗氧化機(jī)理是非常有價(jià)值的。不同溫度下磷脂的存在狀態(tài)不同，這必然導(dǎo)致混合單分子膜某些性質(zhì)發(fā)生改變，同時(shí)會(huì)影響分子間相互作用。因此本文還討論了溫度對(duì)DOPC/蘆丁脂肪酸酯混合單分子膜的成膜性質(zhì)。任何溫度和任何混合比例下的DOPC/RS和DOPC/RL混合單分子膜中的兩組分是完全互容的。溫度越高組分相容性越好。在各種溫度下，RS對(duì)DOPC單分子膜的收縮效果隨表面壓

15、降低而更加顯著。RS對(duì)DOPC單分子膜的收縮作用是由于兩種分子形狀匹配，可以以相互咬合的方式排列。DOPC與RL的相容性比較差，這是由于RL的烴鏈短，在某些條件下兩組分的分子結(jié)構(gòu)不匹配。但升溫或降低RL含量都能改善兩組分的相容性。DOPC/RS混合體系在三個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度的某些條件下都是熱力學(xué)穩(wěn)定的，而DOPC/RL體系只有在37℃時(shí)才在0.2<0.5范圍內(nèi)處于熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)。溫度對(duì)DOPC/RS和DOPC/RL混合單分子膜的C

16、<,s>沒(méi)有影響。任何溫度下，混合單分子膜中蘆丁脂肪酸酯的摩爾含量越大膜越容易被壓縮，且C<,s>隨膜壓的增大而減小。 蘆丁是一類(lèi)重要的黃酮類(lèi)化合物，通過(guò)酶催化酯化引入長(zhǎng)烴基鏈得到的蘆丁脂肪酸酯具有較強(qiáng)的脂溶性，由此推測(cè)它在脂類(lèi)中的抗氧化性將增強(qiáng)。然而至今國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有關(guān)黃酮糖苷脂肪酸酯的抗氧化性研究。本文以反映脂質(zhì)氧化修飾程度的硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(TBARS)為指標(biāo)，研究了含不同長(zhǎng)度烴鏈的RS、RL和RC對(duì)Fe<'2+>介導(dǎo)

17、的卵磷脂氧化修飾的影響。結(jié)果表明蘆丁脂肪酸酯的抗氧化活性?xún)?yōu)于蘆丁。而且RC具有最好的抗氧化活性，能使氧化體系中卵磷脂的MDA含量在四小時(shí)內(nèi)都保持非常低。黃酮類(lèi)化合物在人體內(nèi)主要通過(guò)體液吸收代謝，而RS、RL及RC在水中的溶解度非常小，這將影響它們的抗氧化效果。本文以蘆丁月桂酸酯(RL)為代表，自制了RL-聚乙二醇固體分散體。結(jié)果表明以PEG4000為載體，采用甲醇溶解法制備RL為固體分散體，可以顯著提高RL的溶解度，并起到緩釋RL的效果