抗黃曲霉毒素B1單鏈抗體基因的改造、表達純化和性質研究.pdf

1、黃曲霉毒素B1(AflatxoniBl，AFB1)是毒性最強的真菌毒素之一，它具有致畸致癌致突變的三致作用，由于它在花生、玉米等食品中廣泛存在，因此嚴重危害了人們的健康。
　　 AFB1是一種半抗原，酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)是檢驗半抗原的一種快速、簡便的分析方法，而該檢測方法很大程度上依賴于高質量的抗體。與傳統(tǒng)免疫動物法獲得的抗體相比，重組抗體技術由于采用微生物表達的方法，獲得抗體的周期短，成本低，逐漸成為人們研究的熱點。<

2、br>　　 本實驗在已經從Tomlinson I+J單鏈抗體文庫中篩選出抗AFB1單鏈抗體基因H4的基礎上對其進行表達，以期獲得大量與AFBl結合的單鏈抗體。通過測序發(fā)現(xiàn)H4的前1/5處有一琥珀抑制子TAG，說明即TAG沒有起到終止作用而是由于密碼子的零星改變而被翻譯為谷氨酸。為了保證基因不被提前終止，實驗中將TAG突變?yōu)榫幋a谷氨酸的GAA，之后通過克隆載體、表達載體的構建，再將表達載體轉化表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)和乳酸克魯

3、維酵母GG799，進行誘導表達和生物活性的鑒定實驗。結果表明，突變后的H4即H4-Glu能在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達，表達量為25.5 mg/L，其與AFB1的結合活性明顯；H4-Glu在乳酸克魯維酵母中實現(xiàn)了分泌表達，與AFB1有一定的結合活性，但由于獲得的是單拷貝整合轉化子，表達量不高。
　　 對于獲得的抗體，測定了游離AFB1對其的半數(shù)抑制率IC50及抗體與AFB2，AFG1，AFG2的交叉反應性。AFB1對抗

4、體的IC50為3.77 ng/mL，抗體與AFB2、AFG1、AFG2均有交叉反應，從強到弱依次為AFG1、AFB2、AFG2。實驗發(fā)現(xiàn)純化的抗體在4℃可至少存放3個月；冷凍干燥對抗體的活性有影響，可使其活性損失約50％；抗體可以耐受40℃高溫，保溫4h后活性仍可殘留40％，但不能耐受50℃高溫；中偏堿性條件下有利于抗體的活性保存。
　　 本實驗成功將抗AFB1單鏈抗體基因H4中的TAG突變?yōu)镚AA；分別將其在原核表達系統(tǒng)中的大