基于魯米諾電化學發(fā)光的生物傳感技術研究.pdf

1、電化學發(fā)光或電致化學發(fā)光分析方法(Electrochemiluminescence,ECL)是指直接利用電化學反應形成激發(fā)態(tài)發(fā)光體而發(fā)光或通過電解產(chǎn)物之間、電解產(chǎn)物與體系中某組分之間進行化學反應產(chǎn)生光輻射而實現(xiàn)分析物測定的發(fā)光分析技術,是電化學與化學發(fā)光分析相結合的產(chǎn)物。與傳統(tǒng)的化學發(fā)光分析法相比,ECL分析法不僅具有化學發(fā)光分析法的靈敏度高和線性范圍寬等優(yōu)點,而且在許多方面優(yōu)于化學發(fā)光分析,包括如:第一,不穩(wěn)定的化學試劑和中間體在電極

2、表面定量生成,且迅速進行化學發(fā)光反應；第二,電化學反應可以通過改變所施加的電位加以控制,所以可以有選擇地控制化學反應而不需要采取額外的分離手段；第三,電化學氧化能力是連續(xù)的,在同一化學條件下可以通過控制電位加以改變電化學氧化能力。本論文在全面總結和論述ECL分析的基本原理、常見ECL體系反應機理以及生物傳感器的基本原理、分類、應用等方面的研究等基礎上,進行了以下三方面的研究工作：
　　 ⑴魯米諾電化學發(fā)光體系是基于電化學氧化魯米

3、諾生成自由基,所生成的自由基不穩(wěn)定,再進一步被一些氧化劑氧化產(chǎn)生化學發(fā)光。雖然ECL分析法具有靈敏度高、線性范圍寬和儀器設備簡單等優(yōu)點,但是在中性、弱堿性介質(zhì)這樣有利于生物分子保持活性的環(huán)境中,魯米諾的ECL發(fā)光極弱,傳統(tǒng)的魯米諾ECL應用多在強堿性介質(zhì)中進行。為保持生物分子的活性,考慮利用合理的措施來有效實現(xiàn)魯米諾在中性、弱堿性介質(zhì)環(huán)境中的ECL增敏,對其發(fā)展和應用都有很高的學術和實用價值。在已經(jīng)建立的ECL分析體系的基礎上,探討了納

4、米材料如金溶膠(Au sol)和鉑溶膠(Pt sol)、有機分子如氯霉素(Chioramphenicol,CAP)和半胱氨酸(Cysteine)、以及介質(zhì)體系如微乳液(Microemulsion)和離子液體(Ion Liquid)在中性、弱堿性介質(zhì)中對魯米諾ECL的增敏作用,研究中發(fā)現(xiàn)ECL信號與增敏劑之間均存在可以被實際應用的確定的定量關系,并探討了各體系的增敏機理。在此基礎上,采用吸附、自組裝等手段制備了相關的修飾電極,而且可以有效

5、實現(xiàn)ECL物質(zhì)魯米諾的固定化,在成功提高檢測靈敏度的前提下,實現(xiàn)微量、痕量生物分子(如維生素C、褪黑素、超氧化物歧化酶等)的檢測。
　　 ⑵在中性或弱堿性介質(zhì)中,對溶解氧、過氧化氫(H2O2)、辣根過氧化氫酶(HRP)／H2O2、黃嘌呤氧化酶(XOD)／次黃嘌呤(Xanthine)、尿酸酶(Uricase)／尿酸(UA)以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)等對魯米諾電化學發(fā)光的增敏(或猝滅)行為進行了研究,進而對機理進行了探討。研究結果表明

6、,O2、H2O2及其氧化還原過程中生成的具有更強氧化性的活性氧(Reactiveoxygen species,ROSs)對魯米諾的電化學發(fā)光具有顯著的增敏效果,促進魯米諾中間態(tài)自由基激發(fā),導致ECL,信號增強,在生物反應適合的酸度范同內(nèi),對魯米諾ECL的增敏作用尤其顯著,為研究生物ECL傳感器奠定了良好的基礎。由于辣根過氧化氫酶(HRP)催化H2O2的分解,故猝滅H2O2增敏的魯米諾ECL。其他酶催化反應均可在電極表面產(chǎn)生活性氧物質(zhì),從

7、而增敏魯米諾的ECL,并可建立與相關底物濃度間的定量關系。研究中,結合循環(huán)伏安(Cyclic Voltammetry,CV)法,紫外-可見吸收光譜(Ultraviolet-Visible Absorption Spectrometry,UV-Vis)法等方法探討了有關機理。在此基礎上,采用能較好保持生物分子活性的固定化方法和材料,將生物活性物質(zhì)修飾于電極表面,制備了響應性能優(yōu)良的ECL生物傳感器,穩(wěn)定性好,靈敏度高。將制備的ECL生物傳

8、感器應用到一些生物分子(如超氧化物歧化酶、ALT、尿酸等)的檢測中,均獲得滿意的結果。這些ECL生物傳感器在保持生物分子活性的前提下,兼具了ECL的高靈敏度以及酶的高選擇性,對于相關物質(zhì)的檢測的靈敏度高、檢測限低、具有很強的實用性。
　　 ⑶DNA是生物體的基本遺傳物質(zhì),是遺傳信息的載體,它在生物的生長、發(fā)育和繁殖等生命活動中起著非常重要的作用。建立簡單、敏感、特異和快速的病源、基因和藥物檢測方法,對疾病的預防、診斷和治療具有重

9、要的意義。研究了DNA在弱堿性介質(zhì)中對魯米諾ECL的猝滅作用,并用循環(huán)伏安法、紫外-可見吸收光譜法和熒光光譜法等討論了其猝滅機理。采用金納米粒子(Au NPs)和碳納米管(CNTs)的復合納米材料作為DNA的固定載體,應用魯米諾的ECL作為對DNA響應的信號輸出,制備了一種檢測限低,靈敏度高、重現(xiàn)性好的DNA生物傳感器。對應用ECL技術于不同互補狀態(tài)的寡聚核苷酸雜交的表征進行了研究,結果表明ECL技術可以作為一種可靠的免標記表征雜交狀態(tài)

10、的手段。而藥物與DNA相互作用的研究是認識某些疾病的致病機制和藥物的治療機制的基礎,在闡明DNA結構和功能方面也具有重要意義。研究中探討了利用ECL信號研究藥物小分子如氯霉素(CAP)對DNA的損傷行為,并對其作用機理進行了探討,為藥物小分子損傷DNA的研究提供了一種可靠靈敏的檢測模型。該研究對開發(fā)具有新穎特性的電化學發(fā)光探針和傳感界面構造的新原理和新方法、以及設計和研制適用于檢測蛋白質(zhì)、基因或小分子藥物的高靈敏度、高選擇性、可重復使用