Calcimycin(A23187)生物合成機理的研究.pdf

1、Calcimycin(A23187)是重要的聚醚類抗生素,不僅具有抗革蘭氏陽性菌的作用,還是哺乳動物細胞的氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑和ATP酶的抑制劑,甚至引起細胞凋亡。Calcimycin(A23187)可特異地結合二價金屬陽離子(鈣離子、鎂離子等),常用于鈣離子穿膜時細胞膜生理屬性的研究中。Calcimycin(A23187)的化學結構包含3個部分:α-酮吡咯環(huán)、螺旋環(huán)和氨甲基取代的苯并嗯唑環(huán)。同位素喂養(yǎng)實驗表明吡咯環(huán)來源于脯氨酸,螺旋環(huán)

2、來源于2分子的乙酸和4分子的丙酸,苯并噁唑環(huán)來源于分支酸途徑的3.羥基鄰氨基苯甲酸,N-甲基來源于甲硫氨酸。鑒于calcimycin(A23187)獨特的化學結構與作用機理,科學家們長期以來對其表現(xiàn)出濃厚的興趣,自從1972年發(fā)現(xiàn)以來,16,000多篇文獻報道了calcimycin(A23187)的相關研究,但是其生物合成機理一直懸而未決。本研究旨在分子水平上闡述calcimycin(A23187)的生物合成機理,從而為利用組合生物學手

3、段開發(fā)新的藥物奠定基礎。
　　 根據脯氨酸腺苷轉移酶的保守氨基酸區(qū)域設計兼并引物,通過PCR的方法克隆到了脯氨酸腺苷轉移酶基因,進而從教酒鏈霉菌(Streptomyces chartreusis)NRRL3882的基因組文庫中克隆到了calcimycin(A23187)的生物合成基因簇,并從中挑選p14F11、p16F9和p6F5三個相互重疊的陽性科斯質粒拿去測序。生物信息學顯示測定的101 kb的區(qū)域含有56個開放閱讀框(op

4、en reading frame,ORF),其中的27個ORFs(64 kb)負責calcimycin(A23187)的生物合成。這27個orfs包含:3個orfs(calN1-N3)負責吡咯環(huán)的合成,5個orfs(calA1-A5)編碼I型聚酮合酶負責螺旋環(huán)的合成,4個orfs(calB1-B4)負責3-羥基鄰氨基苯甲酸的合成,1個N-甲基轉移酶基因(calM),1個抗性基因(calT),1個Ⅱ型硫酯酶(calG),3個調節(jié)基因(ca

5、lR1-R3),4個其它基因(calCDFH)和5個未知基因(calU1-U5)。通過同框缺失目標基因,確定了4個基因(calN1、calN2、calB2和calM)跟calcimycin(A23187)的生物合成直接相關,并體外酶活實驗證實了CalM催化A23187的最后一步N-轉甲基反應。以此為基礎結合生物信息學分析和早期的同位素喂養(yǎng)結果成功推測出了calcimycin(A23187)的整個生物合成途徑。
　　 CalN1是

6、輔氨酰基脫氫酶,催化輔氨酰的脫氫反應,生成吡咯環(huán)。CalN2是脯氨酸腺苷轉移酶,特異識別并活化脯氨酸。CalB2是異分支酸酶,催化2-氨基-2-脫氧異分支酸(ADIC)生成2,3-氫-3-羥基鄰氨基苯甲酸(DHHA)。CalM是N-甲基轉移酶,催化calcimycin(A23187)生物合成的最后一步,使中間產物N-demethyl calcimycin(A23187)生成calcimycin(A23187)。體內中斷實驗證明,calN

7、1N282M與calcimycin(A23187)的生物合成直接相關,calN1、calN2、calB2分別同框缺失的突變株都不僅失去了生產calcimycin(A23187)的能力,同時還失去了生產cezomycin和N-demethyl calcimycin(A23187)這2種中間產物的能力;calM同框缺失的突變株失去了生產calcimycin(A23187)的能力,但是仍然積累了大量的cezomycin和N-demethy1

8、calcimycin(A23187)這2種中間產物;calN2、calM的各自回補菌株都恢復了生產這3種抗生素的能力;CalM的體外酶活實驗證明,在S-腺苷甲硫氨酸(SAM)存在下,CalM催化中間產物N-demethyl calcimycin(A23187)生成calcimycin(A23187),這一結果與體內實驗一致。
　　 Calcimycin(A23187)的生物合成起始于脯氨酸,經過腺苷化、脫氫等步驟生成吡咯環(huán),接著