黃脂菌素生物合成機(jī)理研究.pdf

1、黃脂菌素是在2003年從中國(guó)渤海灣的沙土中分離到的灰黃鏈霉菌(Streptomyces flavogriesus)的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)的，具有較好的抗腫瘤活性，同時(shí)對(duì)革蘭氏陽性菌的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。實(shí)驗(yàn)還證實(shí)黃脂菌素能夠有效抑制HSP47蛋白的過量表達(dá)及人類成纖維細(xì)胞膠原分子的合成，從而作為治療纖維化疾病的潛力藥物。黃脂菌素屬于聚環(huán)xanthone類化合物，含有這類化合物共有的xanthone核心環(huán)。這類化合物結(jié)構(gòu)中普遍存在的亞甲基雙氧橋，

2、內(nèi)酰胺環(huán)，同時(shí)含有一個(gè)與xanthone環(huán)相連的氯原子。鑒于黃脂菌素獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)與作用機(jī)理，科學(xué)家們長(zhǎng)期以來對(duì)其表現(xiàn)出濃厚的研究興趣，但其生物合成機(jī)理一直懸而未決。本研究旨在從分子水平上闡明黃脂菌素獨(dú)特的生物合成機(jī)理，從而為揭示聚環(huán)xanthone類化合物共同的生物合成途徑奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為利用組合生物合成手段產(chǎn)生具有更高生物活性的黃脂菌素衍生物提供理論依據(jù)。
　　利用lysolipin生物合成基因簇中的鹵代酶基因llpH為探

3、針，在黃脂菌素產(chǎn)生菌灰黃鏈霉菌的基因組文庫中篩選到16個(gè)陽性克隆，然后利用染色體步移的方法獲得另外14個(gè)陽性克隆，選取其中三個(gè)進(jìn)行序列測(cè)定，得到了92 kb的序列信息。結(jié)合生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)其中49個(gè)基因與黃脂菌素的生物合成相關(guān)，然后通過構(gòu)建40 kb片段缺失突變株對(duì)此預(yù)測(cè)進(jìn)行了證實(shí)。同時(shí)，對(duì)左邊界orf1-5和xanY3-Y5分別進(jìn)行了大片段缺失，確定其左邊界為xanY1；對(duì)右邊界orf6-11進(jìn)行了大片段缺失，結(jié)合生物信息學(xué)分析確

4、定其右邊界為xanC3。從而進(jìn)一步確定黃脂菌素的生物合成基因簇包含49個(gè)基因，包括38個(gè)結(jié)構(gòu)基因、3個(gè)調(diào)節(jié)基因、3個(gè)抗性相關(guān)基因以及5個(gè)功能未知基因。在此基礎(chǔ)上通過對(duì)關(guān)鍵基因的深入研究，解析了黃脂菌素的生物合成途徑。
　　首先對(duì)XanA基因進(jìn)行了體內(nèi)敲除實(shí)驗(yàn)。XanA與酰胺合酶FdmV有較高同源性，推測(cè)其參與了黃脂菌素生物合成過程中δ-內(nèi)酰胺的形成。xanA基因缺失突變株喪失了產(chǎn)生黃脂菌素的能力同時(shí)積累了中間產(chǎn)物8a，用含有完整x

5、anA基因的天然片段進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)恢復(fù)了突變株ZWK2產(chǎn)生黃脂菌素的能力，同時(shí)對(duì)中間產(chǎn)物8a的結(jié)構(gòu)鑒定顯示其不含內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)。證明酰胺合酶基因XanA參與催化了黃脂菌素內(nèi)酰胺環(huán)的形成。
　　其次對(duì)xanO4基因進(jìn)行了體內(nèi)敲除實(shí)驗(yàn)。XanO4與Baeyer-Villiger單加氧酶MtmOIV、GrhO5有較高同源性，推測(cè)其可能參與了xanthone結(jié)構(gòu)形成。xanO4基因缺失突變株喪失了產(chǎn)生黃脂菌素的能力同時(shí)積累了中間產(chǎn)物6。結(jié)構(gòu)鑒定

6、顯示6不含xanthone環(huán)而含有醌式結(jié)構(gòu)，證明XanO4參與催化了黃脂菌素中xanthone結(jié)構(gòu)的形成。將XanO4進(jìn)行表達(dá)純化，構(gòu)建其生化反應(yīng)體系，結(jié)果顯示XanO4能夠利用NADPH但未將6轉(zhuǎn)化為7，同時(shí)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示XanO4與雙組份酶體系中的GrhO5距離最近，表明XanO4需要有其他蛋白輔助共同催化xanthone結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。
　　通過生物信息學(xué)分析，推測(cè)XanO2、XanO5、XanT均可能作為XanO4的輔助蛋

7、白參與xanthone結(jié)構(gòu)的形成，因此對(duì)其進(jìn)行了單個(gè)基因的缺失實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三個(gè)蛋白均未參與xanthone結(jié)構(gòu)的形成，而是與黃脂菌素其它結(jié)構(gòu)的形成相關(guān)。xanO2為黃脂菌素基因簇中唯一的P450單加氧酶基因，xanO2基因缺失突變株喪失了黃脂菌素的產(chǎn)生能力，同時(shí)積累了化合物11a。通過對(duì)11a高分辨質(zhì)譜分析結(jié)合XanO2預(yù)測(cè)的功能推斷XanO2負(fù)責(zé)催化了黃脂菌素前體中C17氧甲基與C19羥基反應(yīng)產(chǎn)生亞甲基雙氧橋結(jié)構(gòu)。XanO5與Ⅱ

8、型聚酮類化合物生物合成中的羥化酶TcmG、GrhO9同源性較高。xanO5基因缺失突變株喪失了黃脂菌素的產(chǎn)生能力，同時(shí)積累了化合物15a、15a高分辨質(zhì)譜分析顯示它比黃脂菌素缺少一個(gè)氧原子，暗示FAD依賴的單加氧酶XanO5負(fù)責(zé)催化黃脂菌素生物合成中的最后一步后修飾，即化合物15a的C4位羥化反應(yīng)。XanT屬于CurD-SchA家族，xanT基因的缺失導(dǎo)致黃脂菌素產(chǎn)量的下降，約為原產(chǎn)量的50％，同時(shí)積累了新的黃脂菌素結(jié)構(gòu)類似物16。對(duì)1

9、6的高分辨質(zhì)譜分析顯示16比6少一個(gè)氧原子，據(jù)此推斷XanT參與了黃脂菌素xanthone結(jié)構(gòu)形成前，從中間產(chǎn)物4轉(zhuǎn)化到5的氧化反應(yīng)過程。剩余的黃脂菌素可能來源于XanT同源蛋白的非特異性催化。
　　同時(shí)，對(duì)黃脂菌素生物合成基因簇與其他聚酮合酶類基因簇進(jìn)行了比較分析。首先，xan基因簇包含五個(gè)連續(xù)基因xanY1-Y5，與甲基供體SAM合成相關(guān)。這五個(gè)基因常見于初級(jí)代謝，在天然產(chǎn)物的生物合成基因簇中并不常見。xanY3-Y5基因的缺

10、失導(dǎo)致了黃脂菌素產(chǎn)量的明顯下降，表明黃脂菌素生物合成利用XanY1-Y5為其提供甲基供體SAM，同時(shí)也可以利用來自初級(jí)代謝的SAM，揭示出黃脂菌素生物合成與初級(jí)代謝間存在相互作用。其次，利用系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)了一類未經(jīng)報(bào)道的C11酮基還原酶XanZ4及其同源蛋白L1pZⅢ、PnxW，目前只見于聚環(huán)xanthone類化合物生物合成基因簇11p，pnx、xan，推測(cè)其負(fù)責(zé)了聚環(huán)xanthone類化合物芳香化前C11位的酮基還原反應(yīng)。