利用細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度變化檢測乙酰膽堿.pdf

1、本論文共包括三部分內(nèi)容： 前言部分首先對激光共聚焦熒光顯微鏡和落射熒光顯微鏡及其工作原理進(jìn)行簡要介紹；然后介紹了細(xì)胞內(nèi)的第二信使一鈣離子以及與之相關(guān)的鈣離子通道，著重介紹了受體門控的鈣通道、膽堿能受體及其效應(yīng)機(jī)制；最后對乙酰膽堿及其檢測方法進(jìn)行了總結(jié)和評述。 第一章采用激光誘導(dǎo)熒光的方法檢測鈣離子，選擇Fluo-3AM為鈣離子熒光探針，通過細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度變化檢測乙酰膽堿的含量。首先，鈣離子熒光探針在室溫下30 m

2、in負(fù)載，在細(xì)胞內(nèi)酯酶的作用下脫掉乙酰甲酯變成Fluo-3，F(xiàn)luo-3與細(xì)胞內(nèi)游離的Ca<'2+>結(jié)合。用激光共聚焦顯微鏡連續(xù)掃描細(xì)胞，獲得加乙酰膽堿前后的熒光圖像。對圖像的分析結(jié)果說明乙酰膽堿能引起細(xì)胞內(nèi)的鈣離子的濃度升高。用落射熒光顯微鏡確定檢測乙酰膽堿的最佳條件，用EMCCD獲得熒光圖像，數(shù)據(jù)結(jié)果由MateMorph軟件測量分析。濃度為5.0X10<'-13>～1.0X10<'-11>mol/L時，乙酰膽堿與熒光信號的增加值有較

3、好的線性關(guān)系，檢測限為3.2×10<'-13>mol/L。 第二章采用微流控分析芯片與單細(xì)胞分析相結(jié)合的方法檢測了乙酰膽堿的含量。通過模塑法制作了通道直徑為約100μm PDMS微流控芯片，利用微流控芯片單細(xì)胞進(jìn)樣。選擇Fluo-3 AM為鈣離子熒光探針，乙酰膽堿刺激單個細(xì)胞。用落射熒光顯微鏡檢測了單個細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>的熒光強(qiáng)度變化。當(dāng)乙酰膽堿濃度為1.0x10<'-13>～3.0X10<'-11>mol/L時，檢測到的熒光