低濃度哇巴因增高豚鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣的可能途徑.pdf

1、本研究擬在正常離體豚鼠心肌細(xì)胞，觀察低濃度哇巴因(OUA)對心肌[Ca2+]i以及哇巴因/Na,K-ATPase/Src/EGFR/RAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，進(jìn)而探討強心苷治療心衰的可能機制。 一、低濃度哇巴因?qū)?xì)胞內(nèi)鈣的影響 目的：探討低濃度哇巴因?qū)?xì)胞內(nèi)鈣的升高作用及其機制。 結(jié)果： (1)不同濃度哇巴因?qū)﹄x體豚鼠心室肌[Ca2+]i的影響OUA10-9～10-6mol/L在正常臺氏液及無鈣臺氏液中均

2、可劑量依賴性升高心室肌[Ca2+]i，但無鈣臺氏液中升高的程度均較在正常臺氏液中顯著為低(p＜0.05)，提示升高心室肌[Ca2+]i的作用既涉及外鈣內(nèi)流，又涉及內(nèi)鈣釋放。 (2)不同濃度Ryanodine對心室肌[Ca2+]i的影響Ryanodine10-810-7mol/l可升高[Ca2+]i，其中以10-7mol/l最明顯；但Ryanodine10-6～10-5mol/l可降低[Ca2+]i，其中以10-5mol/l最明顯

3、；提示其對肌漿網(wǎng)鈣通道有兩種作用，低濃度時可使之開放，高濃度時則抑制其開放。 (3)Ryanodine對OUA升高心室肌[Ca2+]i的影響在用OUA(10-8mol/L)灌流的豚鼠心室肌細(xì)胞，再給于Ryanodine10-5mol/L(抑制肌漿網(wǎng)鈣通道開放)灌流，在正常臺氏液中可部分抑制OUA誘發(fā)的[Ca2+]i的升高，而在無鈣臺氏液中則可完全抑制OUA誘發(fā)的[Ca2+]i的升高。進(jìn)一步提示OUA通過促進(jìn)外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放升高

4、心室肌[Ca2+]i。 (4)OUA(10-8mol/L)在無Na無K臺氏液中對心室肌[Ca2+]的影響。無Na無K臺氏液灌流心肌細(xì)胞可取消Na+，K+-ATP酶的離子泵功能。在無Na無K臺氏液中OUA(10-8mol/L)仍能升高心室肌[Ca2+]i，且升高幅度與在正常臺氏液中的升高幅度相似(p＞0.05)，提示OUA升高[Ca2+]i的作用與Na+,K+-ATP酶的離子泵功能無關(guān)。 結(jié)論：低濃度的哇巴因可通過促進(jìn)外鈣

5、內(nèi)流及內(nèi)鈣釋放而升高豚鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度，此作用與Na+，K+-ATP酶的離子泵功能無關(guān)。 二、低濃度哇巴因升高細(xì)胞內(nèi)鈣的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制 目的：探討低濃度哇巴因是否可通過Na+,K+-ATP酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑升高[Ca2+]i。 結(jié)果： (1)Genistein對OUA(10-8mol/L)升高心室肌[Ca2+]i的影響Src(蛋白酪氨酸激酶)位于Na,K-ATPase信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最上游，Genist

6、ein系Src的一種特異性抑制劑。本研究結(jié)果顯示，Genistein100μmol/L孵育細(xì)胞30min可完全阻斷OUA(10-8mol/L)的升鈣效應(yīng)，50μmol/L僅可部分阻斷OUA(10-8mol/L)的升鈣效應(yīng)，而10μmol/L和1μmol/L則不影響OUA(10-8mol/L)的升鈣效應(yīng)。Genistein對OUA升鈣效應(yīng)的劑量依賴性抑制作用，提示哇巴因/Na,K-ATPase/Src/EGFFR/RAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能介

7、導(dǎo)OUA的升鈣效應(yīng)。 (2)Genistein對ryanodine和BAYK8644所致豚鼠心室肌[Ca2+]i升高的影響 Ryanodine10-7mol/L可開放肌漿網(wǎng)鈣通道，BAYK8644為細(xì)胞膜L-型鈣通道的開放劑，二者可分別使豚鼠心室肌[Ca2+]i升高為6.4％和13.25％。但二者對genistein(100μmol/L)預(yù)孵育過的豚鼠心室肌細(xì)胞卻無明顯升高[Ca2+]i]效應(yīng)，表明genistein抑制

8、Scr后既可影響細(xì)胞的外鈣內(nèi)流，又可影響細(xì)胞的內(nèi)鈣釋放，進(jìn)一步提示哇巴因/Na,K-ATPase/Src/EGFR/RAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能夠介導(dǎo)OUA的升鈣效應(yīng)。 (3)OUA對Src磷酸化的影響磷酸化酪氨酸蛋白包括分子量120KD和70KD兩個條帶，其120KD條帶的密度分別為：陰性對照組5175±1516；100μmol/LOUA組7584±1839；1μmol/LOUA組7229±1704；10nmol/LOUA組7006±

9、1362；Genistein+10nmol/LOUA組5563±1262。其70KD條帶的密度分別為：陰性對照組5632±1993；100μmol/LOUA組7913±1619;1μmol/LOUA組6543±2127；10nmol/LOUA組6359±1861；10nmol/LOUA+Genistein組5654±2106。其中各劑量OUA均能使Src分子量為120KD和70KD的兩個磷酸化條帶的密度較陰性對照組顯著升高(p＜0.05