基于酶催化放大的高靈敏電化學(xué)免疫傳感技術(shù)研究.pdf

1、對(duì)于我們來(lái)說(shuō)，探索開(kāi)發(fā)一些簡(jiǎn)便、廉價(jià)、定量準(zhǔn)確且易于操作推廣的免疫分析方法是一件非常有意義的工作。因?yàn)榫湍壳皝?lái)說(shuō)，盡管免疫分析技術(shù)被應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域中，但其方法普遍存在著檢測(cè)速度慢、靈敏度低、操作繁瑣費(fèi)時(shí)、儀器昂貴且需要專(zhuān)業(yè)技能，只能在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用等缺點(diǎn)。因此，當(dāng)務(wù)之急，應(yīng)當(dāng)建立一些準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、方便攜帶、成本低廉、易于時(shí)實(shí)監(jiān)測(cè)的檢測(cè)方法。 生物免疫傳感器以其所具有的特異的生物識(shí)別功能、極高

2、的選擇性，以及它可與現(xiàn)代的電化學(xué)分析方法相結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)，能產(chǎn)生一些簡(jiǎn)單、結(jié)果精確、靈敏、專(zhuān)一、微量和快速、成本低廉的檢測(cè)方法，是當(dāng)前各學(xué)科領(lǐng)域既新穎又極具吸引力的熱門(mén)研究課題之一。電化學(xué)酶聯(lián)免疫傳感器是一種將抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的融合性技術(shù)。它的基本原理是通過(guò)化學(xué)或生物方法將酶與抗體或抗原結(jié)合起來(lái)，形成酶標(biāo)記物或通過(guò)免疫學(xué)的方法將酶與抗酶體結(jié)合起來(lái)，形成免疫復(fù)合物，這些酶標(biāo)記物或免疫復(fù)合物仍保持其免疫活

3、性，然后它與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的或含酶的免疫復(fù)合物。結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶遇到相應(yīng)的底物時(shí)，催化其發(fā)生水解、氧化或還原反應(yīng)，或形成共價(jià)鍵結(jié)合點(diǎn)，通過(guò)電化學(xué)分析方法進(jìn)行定性、定量測(cè)定。由于電化學(xué)酶聯(lián)免疫傳感器既具有免疫反應(yīng)的特異性又具有電化學(xué)分析的靈敏性，因此其本身具有檢測(cè)設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，使用方便，構(gòu)制酶電極方法靈活，檢測(cè)下限低，體系容易集成化，微型化等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物自動(dòng)化、高靈敏的傳感測(cè)定。本論文基于此做了一些相關(guān)的工

4、作，具體內(nèi)容包括： (1)建立了一種基于納米金上生物沉積鉑而催化氫還原的電化學(xué)免疫分析新方法(第二章)。近年來(lái)，由于各種金屬標(biāo)記物廣泛應(yīng)用于分析領(lǐng)域，使得以金屬為標(biāo)記物的金屬免疫分析有了很大發(fā)展。以膠體金屬顆粒為標(biāo)記的電化學(xué)免疫分析因?qū)嶒?yàn)所需樣品體積小、實(shí)驗(yàn)設(shè)備成本低且靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)成為金屬免疫分析中最常用的一種方法。膠體金屬顆粒作為標(biāo)記物應(yīng)用于金屬免疫分析，一方面是直接利用金屬納米顆粒自身優(yōu)異的光、電化學(xué)性質(zhì)來(lái)進(jìn)行

5、免疫分析，另一方面，通過(guò)在納米顆粒上沉積其它金屬，使分析信號(hào)得到增強(qiáng)。鉑作為一種優(yōu)異的催化劑，已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。而在化學(xué)分析領(lǐng)域中，主要是基于鉑復(fù)合物等<'[43]>為標(biāo)記物及以納米鉑<'[44]>為標(biāo)記物來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)和DNA分析。而我們利用在納米金上生物沉積鉑應(yīng)用于電化學(xué)免疫分析則是首次報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將納米金標(biāo)記的堿性磷酸酶標(biāo)記抗體通過(guò)和目標(biāo)分析物的夾心反應(yīng)固定在聚苯乙烯微孔內(nèi)，催化抗壞血酸磷酸酯水解產(chǎn)生抗壞血酸，使P

6、t(Ⅳ)還原并沉積在納米金表面，沉積的鉑在強(qiáng)酸中溶解釋放并富集到玻碳電極上，能催化酸性溶液中的H<'+>還原成H<,2>，用線(xiàn)性?huà)呙璺蓹z測(cè)出該催化電流大小，該電流大小與在納米金上沉積的鉑的量成線(xiàn)性關(guān)系。因此根據(jù)鉑催化氫還原的電流大小可間接實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物 H IgG的檢測(cè)。 (2)建立了一種基于生物沉積銅，并利用鉑催化氫電化學(xué)還原的電化學(xué)免疫分析新方法(第三章)。在前一章的研究基礎(chǔ)上，我們發(fā)展了另一種新型的電化學(xué)免疫分析方法。當(dāng)鉑沉積

7、在玻碳電極上后，由于鉑的催化作用，能減小H<'+>在玻碳電極上的過(guò)電位，使H<'+>在較正的電位下還原，產(chǎn)生一還原電流，通常稱(chēng)之為催化氫波。通過(guò)把銅沉積在鍍有鉑的玻碳電極上，由于銅附著在鉑上后，降低了鉑的催化催化氫還原的能力，使H<'+>的還原電位向負(fù)方向產(chǎn)生位移。我們將堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體通過(guò)和目標(biāo)分析物H IgG之間的夾心反應(yīng)固定在聚苯乙烯微孔內(nèi)后，利用堿性磷酸酶催化抗壞血酸磷酸酯水解后產(chǎn)生的抗壞血酸將Cu<'2+>催化沉積在具有鉑

8、覆蓋的玻碳電極表面，通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)，根據(jù)鉑催化氫還原的電勢(shì)大小可間接實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物H IgG的檢測(cè)。 (3)建立了一種基于無(wú)需標(biāo)記的聚合酶放大的電化學(xué)方法來(lái)檢測(cè)人血清中的PDGF(第四章)。在人血小板中發(fā)現(xiàn)的血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)作為一種有絲分裂原，能刺激成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分裂增殖，以及誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞趨化<'[49-53]>。PDGF的生物功能包括

9、促進(jìn)胚胎發(fā)育，傷口的愈合以及引起炎癥。盡管在臨床上PDGF沒(méi)有用于疾病診斷，但有大量的研究工作表明在許多疾病的形成過(guò)程中，PDGF/PDGF受體形成的配合物起了很大的作用。例如癌癥，過(guò)去二十多年的研究清楚地表明PDGF在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中扮演了很重要的角色。PDGF除了與癌癥有關(guān)以外，還與人類(lèi)的許多疾病有聯(lián)系。如動(dòng)脈硬化癥，肝硬化，血管球性腎炎等等?；谏鲜鯬DGF的重要性，在本論文中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種靈敏的且無(wú)需標(biāo)記的電化學(xué)生物傳感器，來(lái)

10、實(shí)現(xiàn)對(duì)PDGF簡(jiǎn)便而快速的檢測(cè)。首先將兔抗人PDGF-B抗體固定在電極上，然后通過(guò)該抗體將分析物PDGF-BB捕獲到電極上。PDGF適配體在與模板DNA分子雜交后，在聚合酶作用下沿模板分子延伸并與模板DNA分子形成雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，形成的雙鏈DNA通過(guò)PDGF與其適配體形成的一種蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物固定到電極表面，再將電活性物質(zhì)亞甲基蘭嵌入到雙鏈DNA分子的溝槽結(jié)構(gòu)中。通過(guò)方波脈沖伏安法可以檢測(cè)到亞甲基蘭的氧化峰電流，并可作為對(duì)PDGF-