舒巴坦酶聯(lián)免疫分析技術及電化學免疫傳感器的研究.pdf

1、舒巴坦(Sulbactam，SBT)又稱青霉烷砜酸，是一種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，可與β-內(nèi)酰胺酶發(fā)生強烈的不可逆競爭性反應，使其失去活性，不能被檢出。2009年我國將在乳品中添加β-內(nèi)酰胺酶定義為違法行為，因此，不法分子在β-內(nèi)酰胺酶陽性乳品中添加舒巴坦，以逃避檢測。本研究依據(jù)免疫學基本原理，設計合成免疫原SBT-KLH，免疫動物后獲得SBT多克隆抗體，在此基礎上建立dcELISA與電化學免疫傳感器法檢測乳品中SBT，兩種快速檢測方法均有

2、較高的精確度、靈敏度與特異性。
　　SBT人工抗原的合成和抗體的制備。將鑰孔血藍蛋白(KLH)與卵清白蛋白(OVA)通過活潑酯法偶聯(lián)后，得到免疫原SBT-KLH與包被原SBT-OVA。采用SBT-KLH進行動物免疫程序，免疫完成后心臟取血獲得抗血清，經(jīng)ProteinA-Sepharose4B凝膠柱純化后，獲得SBT多克隆抗體。
　　dcELISA分析方法的建立。對ELISA反應體系的包被抗體質量濃度與酶標抗原稀釋倍數(shù)、封閉液

3、濃度、pH值、離子濃度以及包被條件進行優(yōu)化后，在最適工作濃度下建立舒巴坦直接競爭酶聯(lián)免疫吸附法，該方法在0.0001～10000ng/mL濃度范圍內(nèi)，IC50值為5.25ng/mL，最低檢測限可以達到1.07pg/mL。板內(nèi)、板間平均變異系數(shù)別為6.69％、9.02％，對結構類似物他唑巴坦與克拉維酸的交叉反應率分別為7.12％、0.93％，說明該方法的穩(wěn)定性和特異性較好。選取牛奶、酸奶和奶粉三種樣品，研究基質消除方法，測定加標回收率。采

4、用TCA法處理樣品后，牛奶、酸奶稀釋至40倍，奶粉稀釋至20倍可以消除基質效應，樣品回收率在84.25％～90.11％之間;采用Careez法處理樣品時，牛奶、酸奶稀釋至10倍，奶粉稀釋至5倍可消除基質效應的影響，樣品回收率在80.83％～84.58％之間，采用HPLC法對ELISA法檢測結果進行驗證，相關性良好，說明本研究建立的乳品中SBT殘留檢測的直接競爭ELISA法，測定結果準確可靠。
　　基于羧基化單壁碳納米管/殼聚糖的間

5、接競爭電化學免疫傳感器法。該方法利用超聲制得羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合膜，滴涂在電極，再將SBT-OVA吸附到電極表面，樣品中的SBT與SBT-OVA競爭結合滴涂在電極表面的SBT多克隆抗體。然后辣根過氧化物酶-羊抗兔結合到電極表面，辣根過氧化物酶催化底物，產(chǎn)生電信號，由電信號的變化對SBT進行定量分析。對反應體系優(yōu)化后，在1～100000ng/mL濃度范圍內(nèi)建立標準曲線y=-0.321ln(x)+12.282，R2為0.9918，