三種結(jié)合酶催化機(jī)理的理論研究.pdf

1、酶是自然界中最為常見的生物催化劑，是生物體新陳代謝的基礎(chǔ)。與普通催化劑相比，生物酶具有催化效率高、反應(yīng)條件溫和、高度的專一性等鮮明特征。隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，酶的理論和應(yīng)用也取得了巨大的發(fā)展，已成為工業(yè)生物技術(shù)的核心。近年來，利用計算機(jī)技術(shù)模擬生物大分子進(jìn)行酶催化和酶改造的研究成為生物催化研究的熱點(diǎn)，豐富了人們對酶的催化功能與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系的認(rèn)識和理解。
　　本論文在實(shí)驗(yàn)上最新獲取晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用量子力學(xué)與分子力學(xué)結(jié)合(QM

2、/MM)的方法研究了三種結(jié)合酶的催化機(jī)理。通過計算，預(yù)測了反應(yīng)物、過渡態(tài)、中間體和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，計算了反應(yīng)能壘，給出了反應(yīng)最佳路徑以及決速步驟等，在原子水平上描述了反應(yīng)細(xì)節(jié)。計算結(jié)果不僅解釋了實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，也很好地預(yù)測了關(guān)鍵殘基的作用，彌補(bǔ)了實(shí)驗(yàn)研究的不足。這些研究結(jié)果對相關(guān)酶的研究和改造具有一定的參考價值和指導(dǎo)意義。
　　本論文的主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)乙基丙二酸腦病蛋白質(zhì)1催化氧化谷胱甘肽過硫化物反應(yīng)機(jī)理的研究
　

3、　乙基丙二酸腦病蛋白質(zhì)1(ETHE1)是β-內(nèi)酰胺折疊酶，是非血紅素鐵依賴氧化酶，與細(xì)胞內(nèi)硫化氫含量增加相關(guān)。ETHE1可以催化氧化谷胱甘肽過硫化物(GSSH)，而且對一些生物體的存活是必要的。目前，依據(jù)晶體結(jié)構(gòu)和相似酶半胱氨酸雙加氧酶(CDO)的反應(yīng)，有人提出了ETHE1大致的催化機(jī)理，但具體的反應(yīng)細(xì)節(jié)還不清楚。本文用QM/MM方法研究ETHE1催化底物GSSH氧化反應(yīng)的機(jī)理。結(jié)果表明，鐵超氧復(fù)合物的基態(tài)為五重態(tài)，描述為GSS+·-F

4、e(Ⅱ)-O2·。通過對三條可能的反應(yīng)路徑的計算，也確定了最可能的反應(yīng)歷程:起始于氧分子鍵的斷裂，同時末端氧進(jìn)攻底物的硫原子，生成Fe-O鍵;隨后Fe-O鍵斷裂，生成亞硫酸鹽中間體。此外，研究發(fā)現(xiàn)，與CDO的催化反應(yīng)中存在單重態(tài)和五重態(tài)的自旋交叉現(xiàn)象不同，該反應(yīng)從五重態(tài)的反應(yīng)物經(jīng)過三重態(tài)的中間體生成了七重態(tài)的產(chǎn)物。
　　(2)血清對氧磷酶1催化二氫香豆素水解機(jī)理的理論研究
　　血清對氧磷酶1(PON1)是一種Ca依賴酶，能夠

5、催化多種底物的水解，包括內(nèi)脂、硫代內(nèi)酯、碳酸酯和磷酸三酯，也能夠催化多種內(nèi)脂的形成。為了更好地理解PON1的催化機(jī)理，本論文用QM/MM方法探究PON1的天然底物二氫香豆素的水解機(jī)理。本文提出了兩種可能的反應(yīng)路徑，氨基酸殘基Glu53和His115分別作為堿催化反應(yīng)。結(jié)果表明，兩條路徑的能壘分別為12.5kcal/mol和9.0kcal/mol。反應(yīng)過程中，氨基酸殘基Glu53和His115中的任何一個作為堿催化反應(yīng)，另一個殘基就會和羥

6、基形成氫鍵促使水解進(jìn)行。然而，突變研究表明，Glu53對水解反應(yīng)是必需的;His115不是必需氨基酸，但是可以增加PON1的活性。NPA電荷分布情況表明Ca2+離子沒有作為路易斯酸參與催化反應(yīng)，而是起到固定底物和相關(guān)殘基的作用。另外，Asp269和Ca2+之間存在配位作用且與內(nèi)脂有氫鍵作用，從而促使醇鹽離去基的質(zhì)子化。這些結(jié)果解釋了突變Glu53會導(dǎo)致PON1失活的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，并和實(shí)驗(yàn)上二氫香豆素的水解不受His115突變影響的結(jié)果一致。

7、
　　(3)蛋氨酸γ-裂解酶催化L-蛋氨酸γ-消除反應(yīng)機(jī)理的理論研究
　　蛋氨酸γ-裂解酶(MGL)是吡哆醛5'-磷酸(PLP)鹽依賴酶，能夠催化L-蛋氨酸的γ-消除反應(yīng)。本論文用QM/MM方法研究MGL催化L-蛋氨酸γ-消除反應(yīng)的機(jī)理。根據(jù)計算結(jié)果，這個反應(yīng)機(jī)理被分成了兩部分。第一部分描述了從內(nèi)部醛亞胺到外部醛亞胺的形成過程。其中，一分子水參與到殘基Lys210的離去過程，反應(yīng)能壘為14.6 kcal/mol。在第二部分，

8、我們探究了外部醛亞胺到氨基巴豆酸鹽的反應(yīng)機(jī)理。底物蛋氨酸Cα原子上的質(zhì)子借助Lys210轉(zhuǎn)移到PLP的C4'原子上。而Cβ原子上的質(zhì)子通過Tyr113轉(zhuǎn)移到底物蛋氨酸的S原子上，同時硫基離去生成不飽和酮亞胺。最后，C4'上的質(zhì)子轉(zhuǎn)移到不飽和酮亞胺的末端C原子上，生成氨基巴豆酸鹽。整個反應(yīng)的決速步是Cα上的質(zhì)子的奪取和C4'上的質(zhì)子轉(zhuǎn)移步驟，反應(yīng)能壘分別為21.1 kcal/mol和21.5kcal/mol。計算結(jié)果能夠給PLP-依賴裂解

9、酶反應(yīng)機(jī)理的探究提供有價值的信息。
　　本論文創(chuàng)新點(diǎn):
　　使用QM/MM方法對三種結(jié)合酶的催化機(jī)理進(jìn)行了探究。(1)通過研究硫雙加氧酶催化氧化谷胱甘肽過硫化物的反應(yīng)機(jī)理，確定了超氧復(fù)合物的基態(tài)為五重態(tài)，同時描述了詳細(xì)的反應(yīng)歷程，給出了反應(yīng)中可能存在的自旋交叉現(xiàn)象，對實(shí)驗(yàn)上研究乙基丙二酸腦病變有重要指導(dǎo)意義。(2)通過探究了血清對氧磷酶1催化其天然底物二氫香豆素的水解機(jī)理，消除了機(jī)理上存在的爭議，分析了關(guān)鍵殘基和輔因子Ca2