幾類金屬酶和糖苷酶催化機(jī)理的理論研究.pdf

1、酶是一切生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，幾乎所有細(xì)胞內(nèi)的代謝反應(yīng)都離不開酶的參與。正是由于酶的催化作用，生物代謝活動(dòng)中產(chǎn)生的物質(zhì)和能量才能滿足生物體的需求。由于酶具有傳統(tǒng)催化劑難以與之媲美的高效性和專一性以及催化反應(yīng)類型的多樣性，越來越多的酶已經(jīng)應(yīng)用到環(huán)境、藥物、工業(yè)等領(lǐng)域，可以預(yù)計(jì)未來會(huì)有更多的仿生催化劑和工程酶應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中。對(duì)酶的活性以及特異性機(jī)制的充分認(rèn)識(shí)不僅是了解生命活動(dòng)規(guī)律的基礎(chǔ)，也是對(duì)酶進(jìn)行修飾改造的前提。但由于酶結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)理的復(fù)雜性

2、，僅靠實(shí)驗(yàn)方法難以對(duì)酶催化反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行全面系統(tǒng)的了解。通過理論與計(jì)算化學(xué)方法可以從原子水平上揭示酶催化反應(yīng)的機(jī)理，對(duì)實(shí)驗(yàn)上難以觀測到的過渡態(tài)及中間體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。目前，酶催化反應(yīng)的理論計(jì)算研究是酶催化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。
　　理論計(jì)算化學(xué)方法有很多，研究中需要依據(jù)要解決的問題選擇合適的方法。本論文主要利用量子力學(xué)和分子力學(xué)相結(jié)合的QM/MM方法對(duì)幾類金屬酶和糖苷酶的催化反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，確定了酶催化反應(yīng)的最可能路徑，得

3、到了反應(yīng)中間體及過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)和能量學(xué)信息，明確了酶活性中心殘基在催化過程中所起的作用，計(jì)算結(jié)果揭示了這些酶催化反應(yīng)的機(jī)制，對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象做出解釋，并能與現(xiàn)有的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好地吻合，同時(shí)也對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做了進(jìn)一步的說明和補(bǔ)充，對(duì)相關(guān)酶反應(yīng)機(jī)理的理解解及酶應(yīng)用奠定了必要的理論基礎(chǔ)。
　　主要研究工作如下:
　　(1)AsqJ加雙氧酶催化喹啉生物堿合成機(jī)理的理論研究
　　喹諾酮結(jié)構(gòu)是多種生物活性分子的骨架結(jié)構(gòu)，4'-甲氧基綠霉

4、素中的4-芳基喹啉片段存在于多種喹啉、喹諾酮生物堿中。近期研究表明曲霉屬真菌中的AsqJ酶在4′-甲氧基綠霉素的生物合成中起重要作用，并且AsqJ酶屬于非血紅素FeⅡ/酮戊二酸依賴加雙氧酶。2016年有人報(bào)道了AsqJ與底物結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)AsqJ酶通過催化兩個(gè)非耦合的去飽和化與環(huán)氧化反應(yīng)將底物轉(zhuǎn)化為4’-甲氧基綠霉素?；诘玫降木w結(jié)構(gòu)，本文采用QM/MM方法對(duì)AsqJ催化的去飽和化反應(yīng)與環(huán)氧化反應(yīng)進(jìn)行了研究。計(jì)算結(jié)果表

5、明，F(xiàn)eⅣ-O復(fù)合物需通過一個(gè)異構(gòu)化過程來引發(fā)整個(gè)催化反應(yīng)，在去飽和化過程中，F(xiàn)eⅣ=O復(fù)合物奪取第一個(gè)氫的反應(yīng)是通過σ-通道進(jìn)行的，且該反應(yīng)是催化反應(yīng)的決速步驟，對(duì)應(yīng)的能壘為19.3 kcal/mol。在環(huán)氧化過程中，再次生成的FeⅣ=O復(fù)合物對(duì)去飽和化中間體的C=C進(jìn)行加氧反應(yīng)，對(duì)應(yīng)的能壘為18.1 kcal/mol。此外，基于底物N4位缺少甲基會(huì)導(dǎo)致催化反應(yīng)不能進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)事實(shí)，本文還考察了N4-甲基對(duì)反應(yīng)的影響，計(jì)算發(fā)現(xiàn)，N4-甲

6、基的缺失并未直接影響FeⅣ=O的奪氫反應(yīng)，可能是通過影響酮戊二酸的氧化反應(yīng)而對(duì)催化反應(yīng)產(chǎn)生影響。這些結(jié)果對(duì)進(jìn)一步理解非血紅素加雙氧酶的反應(yīng)機(jī)理以及喹啉生物堿的生物合成路徑提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　　(2)咪唑啉酮酸酶催化機(jī)理的理論研究
　　組氨酸在生物體內(nèi)的降解受到嚴(yán)格控制，自然界中組氨酸的降解路徑從原核生物到真核生物都是高度保守的。咪唑啉酮酸酶(HutI，EC3.5.2.7)是生物體中組氨酸降解路徑中的第三種酶，該酶催化4

7、-咪唑啉酮-5-丙酸(IPA)水解生成L-谷氨酸。前人依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建議了大致的反應(yīng)機(jī)理，但關(guān)于該酶的底物選擇性、水分子活化機(jī)制等問題依然沒有得到解決。本文使用QM/MM方法對(duì)IPA的(S)-和(R)-對(duì)映體的同分異構(gòu)體sIPA-1，SIPA-2，RIPA-1和RIPA-2的催化反應(yīng)進(jìn)行了研究。計(jì)算結(jié)果表明，起水解作用的水分子（與鋅配位的水分子）是E252殘基通過橋連水分子來活化的，且發(fā)生在與底物與酶結(jié)合之前。在底物結(jié)合之后，活化通道就會(huì)

8、被底物阻斷;另外兩個(gè)殘基(D324，H272)不能活化水分子。HutI只能將IPA的兩個(gè)(S)-對(duì)映體中的sIPA-1轉(zhuǎn)換成L-谷氨酸，其能量勢壘為16.6kcal mol-1。而SIPA-2的轉(zhuǎn)換能壘則為21.9 kcal mol-1。然而，對(duì)于兩個(gè)(R)-對(duì)映體來說，RIPA-1能壘更高一些(21.8 kcal mol-1)，RIPA-2在活性位點(diǎn)的結(jié)合作用比sIPA-2更弱?；谟?jì)算結(jié)果，sIPA-1是HutI最佳的底物，而sIP

9、A-2的水解斷鍵可能需要先轉(zhuǎn)化為sIPA-1才能發(fā)生。通過計(jì)算我們給出了HutI催化反應(yīng)的細(xì)節(jié)，明確了HutI酶的底物選擇性，為深入了解L-組氨酸在哺乳動(dòng)物和細(xì)菌中的生物降解路徑提供了理論基礎(chǔ)。
　　(3)氮-乙酰葡糖胺糖苷水解酶催化機(jī)理的理論研究
　　糖類在生物體內(nèi)有許多重要的作用，它除了可以作為結(jié)構(gòu)組分以及提供生物體必要的能量外，還通過對(duì)肽聚糖的修飾在免疫響應(yīng)中扮演重要的角色。肽聚糖(PG)的代謝路徑對(duì)于細(xì)菌的生長至關(guān)重

10、要。β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶(NagZ)是肽聚糖代謝路徑中一種重要蛋白酶。依據(jù)氨基酸順序以及二級(jí)結(jié)構(gòu)的分類，NagZ酶屬于糖苷水解酶第三家族(GH3)。然而，最近的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)NagZ酶...是糖苷磷酸化酶而不是糖苷水解酶。為進(jìn)一步從原子水平上探究NagZ酶的催化機(jī)理，本文用QM/MM方法對(duì)來源于枯草芽孢桿菌的NagZ酶（BsNagZ）的催化反應(yīng)進(jìn)行了研究。計(jì)算結(jié)果表明，整個(gè)催化循環(huán)的決速步是糖基化反應(yīng)，該結(jié)論與實(shí)驗(yàn)研究相符。糖基化反應(yīng)

11、對(duì)應(yīng)的能壘為19.3 kcal/mol，該能壘與實(shí)驗(yàn)上通過使用類似底物進(jìn)行反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)預(yù)測的自由能能壘(16.4 kcal/mol)近似。對(duì)于去糖基化過程，對(duì)水解機(jī)理和磷酸化機(jī)理的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化對(duì)應(yīng)的能壘為(1.8 kcal/mol)，較水解路徑的能壘低(17.7 kcal/mol)，這一結(jié)果支持了之前關(guān)于NagZ酶為磷酸化糖苷酶的結(jié)論。研究還發(fā)現(xiàn)，不論是在糖基化還是去糖基化過程中都有類似于羰基正離子過渡態(tài)的參與，活性中心底物的

12、構(gòu)型變化對(duì)反應(yīng)有較大影響，以上理論計(jì)算與實(shí)驗(yàn)預(yù)測吻合。這些計(jì)算結(jié)果有助于深入理解NagZ酶的催化機(jī)理，有助于針對(duì)GH3家族β-1，4葡糖胺苷酶的抑制劑的研發(fā)。
　　(4)α-1，4-糖苷裂解酶催化機(jī)理的理論研究
　　α-1，4-糖苷裂解酶(GLases，EC4.2.2.13)是糖苷水解酶家族中獨(dú)特的一員，它可以特異性的催化糖原、淀粉以及低聚麥芽糖中α-1，4-糖苷鍵的斷裂，從多糖的非還原端斷開糖苷鍵生成1，5-脫水-D-果糖

13、。之前的研究表明，GLases屬于構(gòu)型保持型糖苷裂解酶，在催化反應(yīng)中涉及到糖苷酶中間體的形成，整個(gè)催化循環(huán)包括羰基化和去糖基化/消除兩個(gè)過程。基于最新發(fā)表的晶體結(jié)構(gòu)(2X2I)，本文用QM/MM方法對(duì)GLases進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，整個(gè)催化循環(huán)包含五步基元反應(yīng)。首先天冬氨酸D665做為路易斯酸，向糖苷氧提供一個(gè)質(zhì)子，同時(shí)糖苷鍵發(fā)生斷裂。然后去質(zhì)子化的D553殘基進(jìn)攻端基碳形成糖苷酶中間體，該中間體的存在在實(shí)驗(yàn)上已得到了論證。在此糖基化

14、過程中普通的保持型糖苷酶是通過協(xié)同機(jī)理進(jìn)行的，而該酶的糖基化過程是分步進(jìn)行的。對(duì)于去糖基化/消除反應(yīng)，我們考慮了反應(yīng)是在麥芽三糖離開活性位點(diǎn)前發(fā)生的或在麥芽三糖離開活性位點(diǎn)之后發(fā)生的兩種情況。計(jì)算結(jié)果表明，麥芽三糖的離去有利于去糖基化/消除反應(yīng)的進(jìn)行，在這步反應(yīng)中，去質(zhì)子化的D553殘基可以作為催化堿來奪取糖環(huán)上C2位置的質(zhì)子，并且去糖基化/消除反應(yīng)中的奪質(zhì)子反應(yīng)是整個(gè)催化反應(yīng)的決速步，兩種情況對(duì)應(yīng)的勢壘分別是20.59和18.53 k

15、cal/mol。糖苷化過程通過D665殘基對(duì)糖苷氧的質(zhì)子化來引發(fā)反應(yīng)，糖苷裂解酶的糖基化過程是通過分步反應(yīng)機(jī)理發(fā)生的，并且去糖基化/消除反應(yīng)是整個(gè)催化循環(huán)的決速步，這些研究結(jié)果對(duì)于理解α-1，4糖苷酶的催化機(jī)理提供了理論依據(jù)，并對(duì)該類酶的工業(yè)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
　　本論文特色和創(chuàng)新之處
　　弄清酶催化反應(yīng)的機(jī)理不僅有助于理解這些蛋白酶的生物學(xué)功能，也是對(duì)這一高效生物催化劑進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用的重要前提。本論文采用理論化學(xué)方法對(duì)兩類

16、金屬酶（AsqJ加雙氧酶、咪唑啉酮酸酶）以及兩類糖苷酶(BsNagZ酶、α-1，4糖苷裂解酶)的催化反應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究，取得了以下重要成果:
　　(1)系統(tǒng)地闡明了AsqJ加雙氧酶催化合成喹啉生物堿的機(jī)制，確定了在AsqJ的催化反應(yīng)中FeⅣ-O的異構(gòu)化是催化反應(yīng)的必需步驟，F(xiàn)eⅣ-O復(fù)合物的奪氫反應(yīng)遵循σ-通道機(jī)理，分步進(jìn)行的環(huán)氧化反應(yīng)和去飽和化過程都經(jīng)歷碳自由基中間體，對(duì)AsqJ不能催化N4-位不含有甲基的底物類似物的本質(zhì)

17、原因進(jìn)行了探討。
　　(2)預(yù)測了咪唑啉酮酸酶(HutI)對(duì)四種4-咪唑啉酮-5-丙酸(IPA)的同分異構(gòu)體的催化活性，闡明了HutI對(duì)底物的選擇性本質(zhì)，解決了實(shí)驗(yàn)上存在爭議的水分子水分子的活化機(jī)制問題，明確了反應(yīng)中鋅離子的作用。
　　(3)從理論闡明了β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶(NagZ)酶屬于磷酸化酶而不是水解酶，即去糖基化過程遵循磷酸化機(jī)理，不論是糖基化還是去糖基化過程中都經(jīng)過類似于羰基正離子過渡態(tài)，明確了對(duì)該酶底物扭曲