滲透劑與人工伴侶耦合作用輔助蘋果酸脫氫酶復性研究.pdf

1、蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase，MDH)是生物體三羧酸循環(huán)中的一種關(guān)鍵酶，在藥物生產(chǎn)過程中利用其催化特性可實現(xiàn)DL-蘋果酸的拆分，從而得到D-蘋果酸這種重要的手性碳源，具有較高的經(jīng)濟價值。同時，MDH多為同源二聚體或四聚體結(jié)構(gòu)，也可以作為研究寡聚蛋白結(jié)構(gòu)和功能的理想模型蛋白質(zhì)。為了開發(fā)實用的蛋白質(zhì)體外復性技術(shù)，并為實際生產(chǎn)中寡聚包含體蛋白的復性提供理論支持，本文選取了基因工程表達產(chǎn)物--大腸桿菌蘋果酸脫氫酶(E.

2、coliMDH，eMDH)包含體作為研究對象，進行了如下復性方法和復性機理的研究。 研究表明，有些滲透劑對某些蛋白質(zhì)的復性有促進作用。因此首先考察了三種滲透劑(蔗糖，海藻糖和甜菜堿)輔助eMDH包含體復性的情況。實驗發(fā)現(xiàn)，蔗糖和甜菜堿在合適的濃度下可明顯提高eMDH的復性水平，在復性酶的終濃度為0.1mg.ml-1時，復性產(chǎn)物的活性從自發(fā)的43U·mg-1分別提高到73U·mg-1和77U·mg-1。但海藻糖的作用則不明顯。通過

3、對外源熒光和圓二色的結(jié)果分析認為，蔗糖主要是抑制蛋白質(zhì)分子的聚集和錯誤折疊，使蛋白質(zhì)正確折疊形成富含α螺旋的二級結(jié)構(gòu)；而甜菜堿則可通過與變性蛋白質(zhì)外露的疏水區(qū)結(jié)合，有效的防止蛋白質(zhì)分子間的錯誤折疊。海藻糖雖然可以抑制蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，使復性產(chǎn)物中β折疊結(jié)構(gòu)含量顯著升高，但α螺旋含量相對較少。 在上述研究的基礎(chǔ)上，又將人工伴侶與滲透劑共同加入復性體系，考察其在輔助eMDH復性過程中可能存在的耦合作用。實驗結(jié)果顯示，在人工伴侶作用

4、的剝離階段添加一定濃度的滲透劑可以進一步提高人工伴侶對eMDH的促進復性作用。復性溫度為4℃、復性酶的終濃度為0.1mg·ml-1時，當加入0.5mol·L-1甜菜堿和蔗糖時，可以將人工伴侶輔助復性的效果從102U·mg-1分別提高到137U·mg-1和133U·mg-1。同時，蔗糖和甜菜堿的加入可以使人工伴侶實現(xiàn)最佳作用時的配比有所降低(如甜菜堿的加入使人工伴侶配比從1:8降低到1:6)，為進一步提高人工伴侶用量創(chuàng)造了空間。但海藻糖依