家蠶表皮型幾丁質(zhì)合成酶基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、昆蟲(chóng)表皮在昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著非常重要的重用，而表皮結(jié)構(gòu)及功能的完整性在很大程度上依賴(lài)于幾丁質(zhì)對(duì)表皮結(jié)構(gòu)的維系。昆蟲(chóng)中負(fù)責(zé)幾丁質(zhì)合成酶(CHS)基因陸續(xù)得到了解析，然而在家蠶中尚沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。
　　 通過(guò)對(duì)昆蟲(chóng)CS表達(dá)譜、基因的體外干涉、突變體表型的研究表明昆蟲(chóng)表皮具有一個(gè)轉(zhuǎn)移的幾丁質(zhì)合成酶，負(fù)責(zé)其幾丁質(zhì)的合成。幾丁質(zhì)合成發(fā)生障礙將直接影響表皮結(jié)構(gòu)，表皮中蛋白質(zhì)的分布和功能也將發(fā)生異常。因而，幾丁質(zhì)合成代謝受阻會(huì)影響到昆蟲(chóng)在

2、各個(gè)變態(tài)時(shí)期的生長(zhǎng)。
　　 家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，同時(shí)也是鱗翅目模式昆蟲(chóng)。由于幾丁質(zhì)不存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，因此，幾丁質(zhì)合成酶也就成為生物防治的一個(gè)重要靶標(biāo)。對(duì)于家蠶幾丁質(zhì)合成酶的研究有助于了解家蠶幾丁質(zhì)合成酶的作用機(jī)理，為其在害蟲(chóng)防治方面的利用奠定基礎(chǔ)。本文利用家蠶基因組數(shù)據(jù)，全基因組芯片數(shù)據(jù)分析了家蠶BmCHS1的基因序列及結(jié)構(gòu)；利用分子克隆技術(shù)獲得了該基因的全長(zhǎng)cDNA片段，分析了其時(shí)期及組織表達(dá)譜，另外還分析了它的進(jìn)化分析

3、。主要結(jié)果如下：
　　 1.家蠶BmCHS1基因的全長(zhǎng)cDNA克隆
　　 通過(guò)生物信息分析，我們?cè)诩倚Q基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到一個(gè)幾丁質(zhì)合成酶基因的部分基因組片段，以此為基礎(chǔ)，結(jié)合EST數(shù)據(jù)，采用分子克隆的方法，得到該基因的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為BmCHS1。BmCHS1全長(zhǎng)5293bp，其中ORF框?yàn)?188bp，5'UTR為726bp，3'UTR為379bp。
　　 2.家蠶BmCHS1基因的結(jié)構(gòu)
　　

4、 經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，家蠶BmCHS1位于4號(hào)染色體上，具有21個(gè)外顯子，20個(gè)內(nèi)含子。且通過(guò)在線(xiàn)軟件分析發(fā)現(xiàn)BmCHS1編碼的蛋白質(zhì)具有13個(gè)跨膜螺旋，為一個(gè)理論等電點(diǎn)6.32，分子量159.5kDa的多次跨膜的蛋白質(zhì)。使用SignalP3.0 Server分析發(fā)現(xiàn)前17個(gè)氨基酸可能為信號(hào)肽。對(duì)基因5'段序列分析發(fā)現(xiàn)，上游存在著包括hunchback，Br-C等7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控位點(diǎn)。
　　 3.家蠶BmCHS1基因的序列進(jìn)化分析

5、
　　 通過(guò)將各種昆蟲(chóng)CHS1蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，CHS1和其他存在于昆蟲(chóng)表皮中的幾丁質(zhì)合成酶表現(xiàn)出更高的同源性，且家蠶BmCHS1和同屬于鱗翅目的甜菜夜蛾的CHS1之間的同源性明顯高于和其他昆蟲(chóng)。分析還發(fā)現(xiàn)各種昆蟲(chóng)的幾丁質(zhì)合成酶與真菌的幾丁質(zhì)合成酶之間的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。
　　 4.家蠶BmCHS1基因的時(shí)空表達(dá)特征
　　 通過(guò)RT-PCR分析家蠶BmCHS1基因在5齡3天各個(gè)組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，BmCHS1