探索神經(jīng)元Nogo-A分子的自主性功能—細(xì)胞存活、神經(jīng)元分化和突起生長.pdf

1、少突膠質(zhì)細(xì)胞來源的Nogo-A是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）重要的軸突抑制因子，其作用機(jī)制和信號(hào)通路已經(jīng)研究得很清楚。然而，近年來多項(xiàng)研究提示，除高表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞中，Nogo-A在多種類型的神經(jīng)元中也呈高表達(dá)，至此，神經(jīng)元Nogo-A的功能開始被廣泛重視。利用基因剔除小鼠，多組研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元中的Nogo-A在皮層發(fā)育，神經(jīng)元遷移與分化，生長錐活性調(diào)節(jié)，突觸穩(wěn)定性，突起生長以及穩(wěn)定內(nèi)膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

2、等過程中都發(fā)揮著重要作用。另外，神經(jīng)退行性疾病小鼠動(dòng)物模型以及癲癇（Seizure）和老年癡呆癥（Alzheimer disease，AD）等疾病標(biāo)本的組織學(xué)結(jié)果也提示，神經(jīng)元Nogo-A表達(dá)的改變可能與神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)程有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究顯示神經(jīng)元的Nogo-A蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、多聚核糖體和細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)上，提示Nogo-A可能與神經(jīng)元的某些自主性功能有關(guān)。本研究旨在系統(tǒng)探討神經(jīng)元中Nogo-A新的自主性功能。
　

3、　獲得的主要結(jié)果如下：
　　1.利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色、亞細(xì)胞分級(jí)分離和Western blot等手段系統(tǒng)考察了神經(jīng)元中Nogo-A的分布與定位情況。結(jié)果顯示，Nogo-A高表達(dá)于胚胎18天大鼠來源的培養(yǎng)皮層神經(jīng)元的胞體、樹突和軸突中。而且，與少突膠質(zhì)細(xì)胞不同的是，神經(jīng)元中氨基端Nogo-A(amino-Nogo-A,186-1004aa)位于細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)一步，Cos7細(xì)胞過表達(dá) Nogo-A實(shí)驗(yàn)證明，Nogo-A高表達(dá)于線粒體、內(nèi)質(zhì)

4、網(wǎng)和高爾基體以及微管豐富的區(qū)域。對(duì)Neuro2A細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色，顯示Nogo-A定位于中心體以及周圍區(qū)域。
　　2.利用TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)探討神經(jīng)元中Nogo-A/amino-Nogo-A的功能，首次發(fā)現(xiàn) Nogo-A/amino-Nogo-A可以拮抗氧化應(yīng)激從而保護(hù)神經(jīng)元。首先，在過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元氧化應(yīng)激（Oxidative stress）細(xì)胞模型上，轉(zhuǎn)導(dǎo)TAT-amino-Nogo-A（TAT-A

5、M），結(jié)果顯示TAT-AM對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷具有顯著的保護(hù)作用；利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)內(nèi)源性Nogo-A表達(dá)則增加神經(jīng)元對(duì)氧化應(yīng)激的易感性。進(jìn)一步，利用超氧陰離子探針（Dihydroethidium，DHE）檢測細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）水平，結(jié)果顯示，TAT-AM能夠顯著減少H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS的增加，進(jìn)而抑制 H2O2誘導(dǎo)的ERK1/2（Extracellula

6、r signal-regulated kinases）的激活和抗凋亡蛋白Bcl-2的減少。截?cái)囿w實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，位于Nogo-A特異中間段的290-562 aa是amino-Nogo-A行使神經(jīng)保護(hù)功能的關(guān)鍵區(qū)段。利用GST pull down和Ni2+ pull down實(shí)驗(yàn)，我們獲得了amino-Nogo-A和Prdx2（Peroxiredoxin2）相互作用的證據(jù)。突變體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明, amino-Nogo-A與Prdx2相互作用

7、降低ROS的水平依賴于關(guān)鍵區(qū)段的424，464和559位點(diǎn)的半胱氨酸（Cys）。
　　3.首次發(fā)現(xiàn)Neuro2A細(xì)胞中Nogo-A有中心體定位。進(jìn)一步研究證明，Cos7細(xì)胞中過表達(dá) Nogo-A可以調(diào)節(jié)乙?；⒐艿霓D(zhuǎn)位。功能學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，在VPA誘導(dǎo)的Neuro2A神經(jīng)元分化模型上，利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)內(nèi)源性Nogo-A表達(dá)后，細(xì)胞分化率和分化細(xì)胞的突起總長度顯著下降，提示神經(jīng)元中的Nogo-A可能正向調(diào)控神經(jīng)元分化和突起生長。<