骨髓源性神經(jīng)元樣細胞與皮質(zhì)神經(jīng)元間功能突觸的建立.pdf

1、神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）以其獨特的自我更新及分化潛能而受到神經(jīng)醫(yī)學界的關(guān)注，NSCs移植或促進自體腦內(nèi)NSCs再生為治療多種損傷或退行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）疾病提供了一種新的策略，已成為CNS疾病治療中引人注目的研究方向。相對于胚胎或成體腦來源NSCs而言，骨髓基質(zhì)細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）源性NSCs具有取材容

2、易、來源充足、可自體移植而不涉及免疫排斥及倫理問題等優(yōu)勢，更適于未來臨床應用。 由于NSCs移植的目的是參與CNS功能損害的修復，因此對于移植NSCs在宿主體內(nèi)的生存轉(zhuǎn)歸與功能追蹤就是非常重要的研究內(nèi)容。本團隊在前期工作中，分別采用5-溴-2’-脫氧尿苷（5-bromo-2’-deoxyuridine，BrdU）、綠熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和菲立磁（Feridex）對移植NSCs進行

3、了生存與轉(zhuǎn)歸的追蹤，在有效區(qū)別宿主細胞與移植細胞的基礎上，評估了移植細胞在體內(nèi)分化、存活和遷移情況并取得樂觀實驗結(jié)果。但目前為止，國內(nèi)外尚難檢索到對移植NSCs發(fā)揮功效進行成功追蹤檢測的研究報導。而為了有效評估NSCs在移植后活體內(nèi)的功能狀態(tài)，必須要先明確所移植的NSCs是否與宿主神經(jīng)細胞進行了有效的功能聯(lián)系，突觸形成則是評估這種功能聯(lián)系的可靠指標之一。 眾所周知，神經(jīng)系統(tǒng)表達功能的基本結(jié)構(gòu)并非單個神經(jīng)細胞，而是需要多組功能相關(guān)

4、的細胞間的相互協(xié)作，神經(jīng)信息的傳遞必需依靠神經(jīng)細胞間形成的突觸連接才能完成。因此，NSCs移植治療CNS損傷，不僅僅要觀察移植的NSCs在體內(nèi)的分化、存活和遷移替代缺失神經(jīng)元的情況，更重要的是要觀察移植的NSCs能否加入到正常的神經(jīng)網(wǎng)絡中，與周圍的神經(jīng)細胞建立起有功的突觸連接，進行神經(jīng)信息的傳遞。本實驗擬采用綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠（green fluorescent protein-gene mouse，GFP-GM）的BMSCs作為移

5、植細胞種子來源，在體外模擬移植的微環(huán)境，建立移植的BMSCs來源神經(jīng)元樣細胞與大腦皮質(zhì)神經(jīng)元共培養(yǎng)體系，利用熒光燃料FM1-43可作為功能性突觸標記物的特點，觀察相當于移植細胞的GFP-GM-BMSCs分化細胞與相當于宿主的神經(jīng)細胞之間形成功能性突觸形成情況，為在后續(xù)干細胞移植治療CNS疾病過程中、進一步探討移植干細胞在體內(nèi)與宿主神經(jīng)細胞功能整合及其機制提供體外實驗依據(jù)。 本實驗選取GFP-GM作為BMSCs的供體源是由于：第一

6、，GFP-GM可以直接提供標記有GFP的BMSCs，克服了以往GFP體外標記過程在一定程度上對細胞活力產(chǎn)生一定影響、標記細胞的時效性難以確定、標記率低等多種問題，更便于NSCs的區(qū)分和追蹤評估。第二，這類GFP基因小鼠的BMSCs同其他所有體細胞一樣、均具有強烈的綠色熒光表達，體外擴增速度快，并且GFP基因在傳代過程中表達穩(wěn)定、細胞增殖對GFP基因的表達無影響，而GFP基因的表達也不會影響到細胞的增殖。 本研究選擇FM1-43作

7、為實驗評估體外共培養(yǎng)突觸形成的手段是因為：近年來FM1-43被廣泛作為標記功能性突觸的工具之一應用于神經(jīng)可塑性研究中，它是一種具有雙極性的熒光燃料，在水溶液中幾乎不發(fā)熒光，可以選擇性地對正在進行內(nèi)吞外吐的生物膜進行染色，當FM143插入胞膜脂質(zhì)雙層后，細胞膜和外吐內(nèi)吞的突觸小泡著色，然后經(jīng)液體將神經(jīng)元胞膜FM1-43洗脫，而被FM1-43著色的突觸小泡經(jīng)膜的回收繼續(xù)發(fā)射熒光。因此可以利用這一特性觀察BMSCs來源的神經(jīng)元樣細胞與宿主神經(jīng)

8、元之間形成的功能性突觸。 第一部分綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓基質(zhì)細胞體外誘導分化為神經(jīng)元樣細胞。 目的:動態(tài)觀察體外培養(yǎng)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓基質(zhì)細胞（green fluorescent protein-gene mouse bone marrow stromal cells，GFP-GM-BMSCs）在無血清培養(yǎng)基+神經(jīng)細胞因子誘導條件下，向神經(jīng)元樣細胞分化的能力。 方法:取GFP轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓，用貼壁法體

9、外培養(yǎng)獲得GFP-GM-BMSCs，在體外培養(yǎng)、擴增、純化。取第3代GFP-GM-BMSCs，用加入有20ng/ml表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、20ng/ml堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的無血清培養(yǎng)基（NEUROBASAL-A+2％B27）誘導GFP-GM-BMSCs分化。誘導第5天，用免疫細胞熒光方法檢測細胞巢蛋白（Nest

10、in）的表達；第10天用神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neurone specific enolase，NSE）、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）免疫細胞化學方法鑒定表達陽性細胞。 結(jié)果: GFP-GM-BMSCs經(jīng)無血清培養(yǎng)基+神經(jīng)細胞因子誘導后，細胞胞體變圓，伸出細長突起，有的突起連接成網(wǎng)，呈神經(jīng)元樣形態(tài)。誘導第5天，可見Nestin表達陽性的細胞，表達率為（40．24

11、±5．09）％；10天后，NSE陽性、GFAP陽性的細胞表達率分別為（36．43±5．27）％、（49．73±6．28）％。 結(jié)論: GFP-GM-BMSCs在體外無血清培養(yǎng)基誘導下，能分化成神經(jīng)元樣細胞；GFP-GM-BMSCs的分化未受到GFP-GM的GFP基因轉(zhuǎn)染影響。 第二部分骨髓源性神經(jīng)細胞與皮質(zhì)神經(jīng)元間功能突觸的建立。 目的:觀察與大腦皮質(zhì)神經(jīng)元共培養(yǎng)的GFP-GM-BMSCs經(jīng)誘導分化成神經(jīng)元樣細胞

12、后，與腦皮質(zhì)神經(jīng)元之間形成功能性突觸的情況。 方法;無菌條件下取GFP-GM骨髓，用貼壁篩選法體外培養(yǎng)獲得GFP-GM-BMSCs，在體外培養(yǎng)、擴增、純化。取第3代GFP-GM-BMSCs，種植到源于C57/BL6（SPF級）小鼠大腦的原代皮質(zhì)組織細胞中，培養(yǎng)介質(zhì)為加有終濃度為20ng/ml EGF、20ng/mlbFGF的無血清培養(yǎng)基（NEUROBASAL-A+2％B27），體外模擬建立細胞移植的共培養(yǎng)體系。設兩組對照實驗：A

13、M-單獨培養(yǎng)的C57/BL6小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元（作為共培養(yǎng)組突觸形成的實驗對照）：B組-單獨培養(yǎng)的GFP-GM-BMSCs（作為誘導的BMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞的實驗對照）。共培養(yǎng)到第10天，利用FM1-43熒光染色檢測活動突觸小泡的特性，通過熒光顯微鏡觀察共培養(yǎng)的兩種細胞之間形成的突觸。 結(jié)果:與神經(jīng)元共培養(yǎng)的GFP-GM-BMSCs，在含有EGF、bFGF的無血清培養(yǎng)基中，7d后分化為神經(jīng)元樣細胞。共培養(yǎng)10天后，GFP-G

14、M-BMSCs來源的綠色細胞胞體、突起及其末端結(jié)構(gòu)上，可見FM1-43染色陽性的突觸囊泡，提示這類細胞正處在與周圍大腦皮質(zhì)神經(jīng)元（非綠色細胞）之間形成突觸連接的進程中。 結(jié)論:體外模擬細胞移植共培養(yǎng)體系中，分化自GFP-GM-BMSCs的神經(jīng)元樣細胞能與神經(jīng)細胞之間形成明顯的突觸樣連接。 小結(jié): 本課題主要研究在體外模擬移植微環(huán)境，建立相當于移植細胞的GFP-GM-BMSCs源性神經(jīng)元樣細胞與相當于宿主神經(jīng)元之間

15、的共培養(yǎng)體系，觀察這兩種細胞之間功能性突觸形成情況。 實驗通過在“體外無血清培養(yǎng)基+神經(jīng)細胞因子”誘導環(huán)境下，誘導GFP-GM-BMSCs分化成為神經(jīng)元樣細胞后、建立GFP-GM-BMSCs與皮質(zhì)神經(jīng)細胞共培養(yǎng)體系，利用FM1-43染料對突觸末端突觸小泡的特異染色，觀察了GFP-GM-BMSCs生長、分化，及與相當于宿主皮質(zhì)的神經(jīng)細胞間突觸的形成情況。 結(jié)果: （一）GFP-GM-BMSCs在體外含EGF、bFG

16、F的無血清培養(yǎng)基中，能分化成神經(jīng)元樣細胞，并在誘導培養(yǎng)第5天，約40．24％±5．09％細胞表達Nestin；第10天，Nestin陽性表達率降低，NSE陽性、GFAP表達陽性的細胞較第5天有明顯增多，分別為36．43％±5．27％和49．73％±6．28％。 （二）GFP-GM-BMSCs在體外無血清培養(yǎng)基誘導下，與神經(jīng)元共培養(yǎng)第7d后分化為神經(jīng)元樣細胞。第10天，F(xiàn)M1-43陽性染色的突觸小泡分別出現(xiàn)在大腦皮質(zhì)神經(jīng)元和分化自