骨髓源性神經(jīng)元樣細(xì)胞與皮質(zhì)神經(jīng)元間功能突觸的建立.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）以其獨(dú)特的自我更新及分化潛能而受到神經(jīng)醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，NSCs移植或促進(jìn)自體腦內(nèi)NSCs再生為治療多種損傷或退行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）疾病提供了一種新的策略，已成為CNS疾病治療中引人注目的研究方向。相對(duì)于胚胎或成體腦來(lái)源NSCs而言，骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）源性NSCs具有取材容

2、易、來(lái)源充足、可自體移植而不涉及免疫排斥及倫理問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)，更適于未來(lái)臨床應(yīng)用。 由于NSCs移植的目的是參與CNS功能損害的修復(fù)，因此對(duì)于移植NSCs在宿主體內(nèi)的生存轉(zhuǎn)歸與功能追蹤就是非常重要的研究?jī)?nèi)容。本團(tuán)隊(duì)在前期工作中，分別采用5-溴-2’-脫氧尿苷（5-bromo-2’-deoxyuridine，BrdU）、綠熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和菲立磁（Feridex）對(duì)移植NSCs進(jìn)行

3、了生存與轉(zhuǎn)歸的追蹤，在有效區(qū)別宿主細(xì)胞與移植細(xì)胞的基礎(chǔ)上，評(píng)估了移植細(xì)胞在體內(nèi)分化、存活和遷移情況并取得樂(lè)觀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但目前為止，國(guó)內(nèi)外尚難檢索到對(duì)移植NSCs發(fā)揮功效進(jìn)行成功追蹤檢測(cè)的研究報(bào)導(dǎo)。而為了有效評(píng)估NSCs在移植后活體內(nèi)的功能狀態(tài)，必須要先明確所移植的NSCs是否與宿主神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了有效的功能聯(lián)系，突觸形成則是評(píng)估這種功能聯(lián)系的可靠指標(biāo)之一。 眾所周知，神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)功能的基本結(jié)構(gòu)并非單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，而是需要多組功能相關(guān)

4、的細(xì)胞間的相互協(xié)作，神經(jīng)信息的傳遞必需依靠神經(jīng)細(xì)胞間形成的突觸連接才能完成。因此，NSCs移植治療CNS損傷，不僅僅要觀察移植的NSCs在體內(nèi)的分化、存活和遷移替代缺失神經(jīng)元的情況，更重要的是要觀察移植的NSCs能否加入到正常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，與周圍的神經(jīng)細(xì)胞建立起有功的突觸連接，進(jìn)行神經(jīng)信息的傳遞。本實(shí)驗(yàn)擬采用綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠（green fluorescent protein-gene mouse，GFP-GM）的BMSCs作為移

5、植細(xì)胞種子來(lái)源，在體外模擬移植的微環(huán)境，建立移植的BMSCs來(lái)源神經(jīng)元樣細(xì)胞與大腦皮質(zhì)神經(jīng)元共培養(yǎng)體系，利用熒光燃料FM1-43可作為功能性突觸標(biāo)記物的特點(diǎn)，觀察相當(dāng)于移植細(xì)胞的GFP-GM-BMSCs分化細(xì)胞與相當(dāng)于宿主的神經(jīng)細(xì)胞之間形成功能性突觸形成情況，為在后續(xù)干細(xì)胞移植治療CNS疾病過(guò)程中、進(jìn)一步探討移植干細(xì)胞在體內(nèi)與宿主神經(jīng)細(xì)胞功能整合及其機(jī)制提供體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)選取GFP-GM作為BMSCs的供體源是由于：第一

6、，GFP-GM可以直接提供標(biāo)記有GFP的BMSCs，克服了以往GFP體外標(biāo)記過(guò)程在一定程度上對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生一定影響、標(biāo)記細(xì)胞的時(shí)效性難以確定、標(biāo)記率低等多種問(wèn)題，更便于NSCs的區(qū)分和追蹤評(píng)估。第二，這類GFP基因小鼠的BMSCs同其他所有體細(xì)胞一樣、均具有強(qiáng)烈的綠色熒光表達(dá)，體外擴(kuò)增速度快，并且GFP基因在傳代過(guò)程中表達(dá)穩(wěn)定、細(xì)胞增殖對(duì)GFP基因的表達(dá)無(wú)影響，而GFP基因的表達(dá)也不會(huì)影響到細(xì)胞的增殖。 本研究選擇FM1-43作

7、為實(shí)驗(yàn)評(píng)估體外共培養(yǎng)突觸形成的手段是因?yàn)椋航陙?lái)FM1-43被廣泛作為標(biāo)記功能性突觸的工具之一應(yīng)用于神經(jīng)可塑性研究中，它是一種具有雙極性的熒光燃料，在水溶液中幾乎不發(fā)熒光，可以選擇性地對(duì)正在進(jìn)行內(nèi)吞外吐的生物膜進(jìn)行染色，當(dāng)FM143插入胞膜脂質(zhì)雙層后，細(xì)胞膜和外吐內(nèi)吞的突觸小泡著色，然后經(jīng)液體將神經(jīng)元胞膜FM1-43洗脫，而被FM1-43著色的突觸小泡經(jīng)膜的回收繼續(xù)發(fā)射熒光。因此可以利用這一特性觀察BMSCs來(lái)源的神經(jīng)元樣細(xì)胞與宿主神經(jīng)

8、元之間形成的功能性突觸。 第一部分綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。 目的:動(dòng)態(tài)觀察體外培養(yǎng)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞（green fluorescent protein-gene mouse bone marrow stromal cells，GFP-GM-BMSCs）在無(wú)血清培養(yǎng)基+神經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)條件下，向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的能力。 方法:取GFP轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓，用貼壁法體

9、外培養(yǎng)獲得GFP-GM-BMSCs，在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、純化。取第3代GFP-GM-BMSCs，用加入有20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的無(wú)血清培養(yǎng)基（NEUROBASAL-A+2％B27）誘導(dǎo)GFP-GM-BMSCs分化。誘導(dǎo)第5天，用免疫細(xì)胞熒光方法檢測(cè)細(xì)胞巢蛋白（Nest

10、in）的表達(dá)；第10天用神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neurone specific enolase，NSE）、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)果: GFP-GM-BMSCs經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基+神經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，細(xì)胞胞體變圓，伸出細(xì)長(zhǎng)突起，有的突起連接成網(wǎng)，呈神經(jīng)元樣形態(tài)。誘導(dǎo)第5天，可見Nestin表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，表達(dá)率為（40．24

11、±5．09）％；10天后，NSE陽(yáng)性、GFAP陽(yáng)性的細(xì)胞表達(dá)率分別為（36．43±5．27）％、（49．73±6．28）％。 結(jié)論: GFP-GM-BMSCs在體外無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，能分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞；GFP-GM-BMSCs的分化未受到GFP-GM的GFP基因轉(zhuǎn)染影響。 第二部分骨髓源性神經(jīng)細(xì)胞與皮質(zhì)神經(jīng)元間功能突觸的建立。 目的:觀察與大腦皮質(zhì)神經(jīng)元共培養(yǎng)的GFP-GM-BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞

12、后，與腦皮質(zhì)神經(jīng)元之間形成功能性突觸的情況。 方法;無(wú)菌條件下取GFP-GM骨髓，用貼壁篩選法體外培養(yǎng)獲得GFP-GM-BMSCs，在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、純化。取第3代GFP-GM-BMSCs，種植到源于C57/BL6（SPF級(jí)）小鼠大腦的原代皮質(zhì)組織細(xì)胞中，培養(yǎng)介質(zhì)為加有終濃度為20ng/ml EGF、20ng/mlbFGF的無(wú)血清培養(yǎng)基（NEUROBASAL-A+2％B27），體外模擬建立細(xì)胞移植的共培養(yǎng)體系。設(shè)兩組對(duì)照實(shí)驗(yàn)：A

13、M-單獨(dú)培養(yǎng)的C57/BL6小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元（作為共培養(yǎng)組突觸形成的實(shí)驗(yàn)對(duì)照）：B組-單獨(dú)培養(yǎng)的GFP-GM-BMSCs（作為誘導(dǎo)的BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)對(duì)照）。共培養(yǎng)到第10天，利用FM1-43熒光染色檢測(cè)活動(dòng)突觸小泡的特性，通過(guò)熒光顯微鏡觀察共培養(yǎng)的兩種細(xì)胞之間形成的突觸。 結(jié)果:與神經(jīng)元共培養(yǎng)的GFP-GM-BMSCs，在含有EGF、bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)基中，7d后分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。共培養(yǎng)10天后，GFP-G

14、M-BMSCs來(lái)源的綠色細(xì)胞胞體、突起及其末端結(jié)構(gòu)上，可見FM1-43染色陽(yáng)性的突觸囊泡，提示這類細(xì)胞正處在與周圍大腦皮質(zhì)神經(jīng)元（非綠色細(xì)胞）之間形成突觸連接的進(jìn)程中。 結(jié)論:體外模擬細(xì)胞移植共培養(yǎng)體系中，分化自GFP-GM-BMSCs的神經(jīng)元樣細(xì)胞能與神經(jīng)細(xì)胞之間形成明顯的突觸樣連接。 小結(jié): 本課題主要研究在體外模擬移植微環(huán)境，建立相當(dāng)于移植細(xì)胞的GFP-GM-BMSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞與相當(dāng)于宿主神經(jīng)元之間

15、的共培養(yǎng)體系，觀察這兩種細(xì)胞之間功能性突觸形成情況。 實(shí)驗(yàn)通過(guò)在“體外無(wú)血清培養(yǎng)基+神經(jīng)細(xì)胞因子”誘導(dǎo)環(huán)境下，誘導(dǎo)GFP-GM-BMSCs分化成為神經(jīng)元樣細(xì)胞后、建立GFP-GM-BMSCs與皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，利用FM1-43染料對(duì)突觸末端突觸小泡的特異染色，觀察了GFP-GM-BMSCs生長(zhǎng)、分化，及與相當(dāng)于宿主皮質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞間突觸的形成情況。 結(jié)果: （一）GFP-GM-BMSCs在體外含EGF、bFG

16、F的無(wú)血清培養(yǎng)基中，能分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞，并在誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天，約40．24％±5．09％細(xì)胞表達(dá)Nestin；第10天，Nestin陽(yáng)性表達(dá)率降低，NSE陽(yáng)性、GFAP表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞較第5天有明顯增多，分別為36．43％±5．27％和49．73％±6．28％。 （二）GFP-GM-BMSCs在體外無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，與神經(jīng)元共培養(yǎng)第7d后分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。第10天，F(xiàn)M1-43陽(yáng)性染色的突觸小泡分別出現(xiàn)在大腦皮質(zhì)神經(jīng)元和分化自