NGF體外誘導(dǎo)hMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞.pdf

1、目的:
　　探索人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow stromal cells,hMSCs)體外分離、培養(yǎng)及純化的合適實驗條件,并探討神經(jīng)生長因子體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)分化成神經(jīng)細(xì)胞的可行性。
　　方法:
　　①從正常成人髂骨中獲取 hMSCs,采用密度梯度離心法和全骨髓貼壁法相結(jié)合的方法分離人骨髓低密度單個核細(xì)胞,常規(guī)傳代、培養(yǎng)獲得純化的hMSCs。
　?、谌〉?、4、6代

2、生長狀態(tài)良好的hMSCs,以含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)消化后,采用MTT法,描繪細(xì)胞增殖曲線。
　　③取第3~5代hMSCs,接近70％~80%融合后,分為實驗組:用堿性成纖維生長因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)對 hMSCs進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)24h,再分別用濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml神經(jīng)生長因子培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化;對照組:僅加等量無血清培養(yǎng)基。

3、通過形態(tài)學(xué)觀察誘導(dǎo)后各組細(xì)胞形態(tài)變化。
　?、芗?xì)胞培養(yǎng)后,第0.5d、1d、3d、5d,采用免疫組織化學(xué)法檢測神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)的表達(dá),選細(xì)胞密度適中視野計算陽性細(xì)胞數(shù),對比各組細(xì)胞陽性表達(dá)比例。
　　結(jié)果:
　　①骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線:培養(yǎng)第1~2d為潛伏期,細(xì)胞生長緩慢;此后,細(xì)胞增殖加快并迅速進(jìn)入對數(shù)生長期,至第6~7d達(dá)到高峰,以后細(xì)胞增殖減慢,進(jìn)入平臺期

4、。
　?、趆MSCs誘導(dǎo)分化后的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果:12h后部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,表現(xiàn)為胞體變大,有類似軸突和樹突的細(xì)長突起,24h后表現(xiàn)更為明顯,部分細(xì)胞間也可見網(wǎng)絡(luò)狀排列,細(xì)胞死亡現(xiàn)象不明顯;對照組無明顯的形態(tài)學(xué)改變,仍為長梭形細(xì)胞。
　?、凵窠?jīng)元樣細(xì)胞免疫組化測定結(jié)果:不同濃度神經(jīng)生長因子組NSE、 Nestin表達(dá)均為陽性,表現(xiàn)為胞體和突起被染成棕黃色;對照組無陽性結(jié)果出現(xiàn)。
　?、懿煌瑵舛壬窠?jīng)生長因子作用下的神經(jīng)

5、元樣細(xì)胞分化率有差別。濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、及200ng/ml分化率分別為(35.6±4.4)%、(61.9±3.4)%、(57.3±5.7)%和(57.2±4.8)%,不同濃度的神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)陽性細(xì)胞數(shù)有顯著差異(F=338.71,P<0.05),其中100ng/ml組的分化率最高,各實驗組比較:濃度為100ng/ml、濃度為150ng/ml及濃度為200ng/ml組陽性細(xì)胞數(shù)均高于濃度為50ng

6、/ml組(P<0.01),但后三者比較,差異無顯著性(P>0.05)。
　　⑤100ng/ml NGF在0.5d、1d、3d、5d的分化率分別為(27.8±5.6)%、(60.5±6.7)%、(61.9±3.4)%和(30.7±3.5)%,不同時間相同濃度下神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)陽性細(xì)胞數(shù)有顯著差異(F=136.03,P<0.01),其中第3d的分化率最高,但與第1d陽性細(xì)胞數(shù)比較,差異無顯著性(P>0.05),第5d的陽性細(xì)胞數(shù)減少,