定量聚合酶鏈反應(yīng)熱循環(huán)系統(tǒng)及熒光檢測技術(shù)研究.pdf

1、聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的體外DNA快速擴(kuò)增技術(shù)，在其基礎(chǔ)上發(fā)明的定量PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)物中DNA含量的準(zhǔn)確定量計(jì)算，高性能的熱循環(huán)系統(tǒng)和熒光檢測系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)DNA擴(kuò)增和定量的基礎(chǔ)。本文對(duì)定量PCR中的熱循環(huán)和熒光檢測系統(tǒng)進(jìn)行了研究：
　　 熱循環(huán)系統(tǒng)是DNA實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的反應(yīng)場所，本文設(shè)計(jì)了基于半導(dǎo)體制冷技術(shù)和嵌入式技術(shù)設(shè)計(jì)了PCR熱循環(huán)系統(tǒng)。為了

2、獲得系統(tǒng)中各部件的準(zhǔn)確參數(shù)，根據(jù)熱電類比方法，建立了熱循環(huán)系統(tǒng)的等效電路模型，利用該模型對(duì)熱循環(huán)系統(tǒng)一維穩(wěn)態(tài)和動(dòng)態(tài)熱性能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明該方法可以準(zhǔn)確的對(duì)PCR熱循環(huán)系統(tǒng)的一維熱性能進(jìn)行評(píng)估，并且可根據(jù)分析結(jié)果確定系統(tǒng)中各部件參數(shù)，使系統(tǒng)溫度獲得較好的穩(wěn)態(tài)和動(dòng)態(tài)性能。
　　 PCR反應(yīng)對(duì)溫度要求較高，因此需要對(duì)熱循環(huán)系統(tǒng)的溫度控制方法進(jìn)行研究，提高系統(tǒng)的溫度控制精度。根據(jù)熱循環(huán)系統(tǒng)的溫度變化特點(diǎn)，提出了一種多模態(tài)分段控制策略

3、，在升溫和降溫初期使用模糊控制方法，可以使系統(tǒng)獲得最快的升降溫速度，在升降溫后期使用自適應(yīng)模糊PID控制方法，可以有效提高溫度穩(wěn)態(tài)精度。實(shí)驗(yàn)表明，系統(tǒng)的最快升溫速度大于4℃/s，最快降溫速度大于2℃/s，穩(wěn)態(tài)精度可以控制在0.2℃以內(nèi)。通過實(shí)驗(yàn)得到了加熱和制冷模式下，樣品塊到試液間溫度傳遞時(shí)間與溫度值關(guān)系，以保證PCR反應(yīng)物有充分反應(yīng)時(shí)間。
　　 溫度均勻性是系統(tǒng)中各樣品等效率擴(kuò)增的前提和保證。針對(duì)孔板式PCR普遍存在的溫度場均

4、勻性問題，利用有限元分析方法對(duì)影響系統(tǒng)溫度均勻性的因素進(jìn)行了研究，樣品塊表面與周圍環(huán)境發(fā)生的熱交換以及半導(dǎo)體制冷片之間的匹配誤差是造成溫度場均勻性差的主要原因。將半導(dǎo)體制冷片匹配誤差控制在0.5％以內(nèi)，再對(duì)熱循環(huán)系統(tǒng)采取相應(yīng)的隔熱或熱補(bǔ)償措施，可以將系統(tǒng)溫度均勻性控制在0.4℃以內(nèi)。在此熱循環(huán)系統(tǒng)中對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PCR樣品進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳成像結(jié)果表明系統(tǒng)的溫度控制精度與均勻性可以滿足PCR樣品的高效擴(kuò)增要求。
　　 定量PC

5、R通過檢測反應(yīng)體系中添加的熒光物質(zhì)的熒光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)反應(yīng)物中DNA數(shù)量進(jìn)行定量計(jì)算。根據(jù)熒光分析法原理和定量PCR反應(yīng)過程中熒光染料的光譜特性，在基于共焦式熒光檢測方法的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一種新型的定量PCR共焦熒光檢測系統(tǒng)，使用光電倍增管和窄帶濾光片對(duì)不同波長熒光信號(hào)進(jìn)行檢測。分析測試了熒光檢測系統(tǒng)的噪聲來源、降噪性能和熒光信號(hào)倍增效果，對(duì)采集到的熒光信號(hào)在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行數(shù)據(jù)段選取和數(shù)字濾波處理，最終計(jì)算出每個(gè)樣品的熒光信號(hào)峰值。通過對(duì)不同濃