聚合酶鏈反應(yīng)及基因突變檢測(cè)方法

1、聚合酶鏈反應(yīng)及基因突變檢測(cè)方法,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉湘帆 講師,,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)于1983年由美國(guó)Cetus公司的K.Mullis建立，并和定點(diǎn)突變的發(fā)明者M(jìn).Smith一起榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究開(kāi)創(chuàng)了嶄新時(shí)代。,PCR反應(yīng)的特點(diǎn),特異性強(qiáng) 引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實(shí)性 靈敏度高 指數(shù)增長(zhǎng)，從pg (10-12)可擴(kuò)增至 mg (10-6)水平 簡(jiǎn)便、快速 2～4

2、小時(shí)完成擴(kuò)增對(duì)標(biāo)本的純度要求低 DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板,一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程,DNA的體外復(fù)制包括3個(gè)步驟：變性（denaturation）:94 ?C ~95 ?C 退火（annealing）:40 ?C ~70 ?C 延伸（extension）:72 ?C 3個(gè)步驟作為PCR的一個(gè)循環(huán)，每當(dāng)完成一個(gè)循環(huán)，一個(gè)分子的模板被復(fù)制為二個(gè)，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長(zhǎng)。,PCR原理,d.N

3、TPs,耐熱DNA聚合酶,引物,添加反應(yīng)混合液及樣本,,變性,,退火,加入試管中,,,延伸,繼續(xù)延伸,,循環(huán),PCR原理,第二個(gè)循環(huán)4個(gè)拷貝,第三個(gè)循環(huán)8個(gè)拷貝,,,第n個(gè)循環(huán)2n個(gè)拷貝,PCR原理,The Polymerase Chain Reaction (PCR),18,,,,20-30X,,,,,94 ?C(30 s),,,40-60 ?C(30 s),,,,,,,,,,,,72 ?C(30-60 s/kb),,,

4、,Melt,Anneal,Extend,Cycle #2,NIH,,,,20-30X,,,,,二、PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,（一）PCR反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和緩沖液等。,1 模板,包括基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA等 模板DNA需較高的濃度 RNA作為模板時(shí)，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以 cDNA作為擴(kuò)增的模板 模板量

5、：1000ng、500ng、100ng、50ng?,2、引 物（Primers),引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度，是化學(xué)合成的寡核苷酸片段化學(xué)合成的寡核苷酸能與模板特異地結(jié)合引物決定產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循一些原則,設(shè)計(jì)引物的原則：,二條引物分別位于被擴(kuò)增片段的兩端，與模板正負(fù)鏈序列互補(bǔ)長(zhǎng)度為18 ~ 25個(gè)核苷酸二條引物之間避免形成引物二聚體引物的堿基組成應(yīng)平衡引物退火溫度計(jì)算：Tm=2（A+T）

6、+4（C+G）引物的5`端可被修飾（引入酶切位點(diǎn)、引入突變位點(diǎn)、生物素等標(biāo)記）,引物濃度：0.1 ~ 0.2umol/L,濃度過(guò)高容易生成引物二聚體,3、脫氧核苷三磷酸（dNTP）,是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4種脫氧 核苷三磷酸的混合物 反應(yīng)體系中各種核苷酸的濃度必須一致 濃度過(guò)高雖能加快反應(yīng)速度，但非特異 性擴(kuò)增也隨之增加 dNTP濃度：20 ~ 200umol/L,濃度升高增加非特異性擴(kuò)增,

7、4、DNA聚合酶,從一種生活在熱泉（80℃~90℃）中的水棲 噬熱菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取， 有很高的耐熱穩(wěn)定性 Taq 酶的作用: 模板指導(dǎo)下，以dNTP為原料，在引物3’-OH末端加上脫氧單核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。 最適酶量：1-2.5U （酶量過(guò)多，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增）,,Taq DNA聚合酶復(fù)制的保真性：Ta

8、q DNA聚合酶無(wú)3’ → 5’外切酶活性，因而無(wú)校正功能，在復(fù)制新鏈的過(guò)程中會(huì)發(fā)生堿基錯(cuò)配。Taq DNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000，故擴(kuò)增的片段越長(zhǎng)，錯(cuò)配的機(jī)率越高。,,耐熱的 DNA多聚酶：Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有較高的熱穩(wěn)定性，較高的保真性，降低堿基錯(cuò)配率2 ~ 10倍。,5、鎂離子濃

9、度,鎂離子濃度是一個(gè)至為關(guān)鍵的因素，對(duì)于反應(yīng) 系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影響 雖然Taq 酶的活性只與游離的Mg2+濃度有關(guān)， 但PCR反應(yīng)體系中dNTP、引物、模板DNA及 鰲合劑的存在均可與Mg2+結(jié)合而降低游離 Mg2+的濃度從而影響酶的活性。 當(dāng)dNTP濃度為200umol/L時(shí)，MgCl2的濃度為1.5mmol/L較宜。,6、其它反應(yīng)因素,pH：調(diào)節(jié)至酶反應(yīng)所需

10、的最適pH（ pH =7.2左右）鹽：合適的鹽濃度有利于穩(wěn)定雜交體，有利于引物與模板雜交基質(zhì)：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明膠等基質(zhì)可以保護(hù)Taq 酶的活性）,（二）PCR的反應(yīng)條件,反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）反應(yīng)時(shí)間（變性、退火、延伸）循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）,1、溫度,變性溫度：94 ~ 97 ℃ 退火溫度：低于引物Tm 5 ℃左右 溫度過(guò)

11、高：降低擴(kuò)增效率； 溫度過(guò)低：增加非特異性擴(kuò)增 延伸溫度：72度，此時(shí)Taq酶具有較高的酶 促活性,2、時(shí)間,第一次變性應(yīng)給予足夠時(shí)間（5 ~ 7分鐘） 每一個(gè)步驟所需時(shí)間取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，一般為30秒~ 1分鐘，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增,3、循環(huán)次數(shù),重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為25～35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的平臺(tái)效應(yīng)： 理論上，PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長(zhǎng)，但這種

12、增長(zhǎng)形式在擴(kuò)增25-25個(gè)循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)，此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長(zhǎng),指數(shù)增長(zhǎng)期線形增長(zhǎng)期平臺(tái)期,循環(huán)數(shù) #,PCR過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),,平臺(tái)出現(xiàn)得遲早與模板的初始量有關(guān)，模板初始量越多，平臺(tái)出現(xiàn)得越早。平臺(tái)效應(yīng)產(chǎn)生的因素： 引物二聚體的產(chǎn)生、反應(yīng)產(chǎn)物、各組分的消耗和變性、引物和已擴(kuò)增的DNA片段間的競(jìng)爭(zhēng)等,三、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制,（一）實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置：

13、 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū) 標(biāo)本制備區(qū) 擴(kuò)增反應(yīng)區(qū) 產(chǎn)物分析區(qū) PCR技術(shù)的質(zhì)量保證： 基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的全過(guò)程的質(zhì)量保證 室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評(píng)價(jià) PCR實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的污染源及防污染措施,,防污染體系：正確設(shè)置實(shí)驗(yàn)室、嚴(yán)格規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作、完整有效的去污染措施、反應(yīng)體系中以dUTP取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可破壞以往的擴(kuò)增產(chǎn)物、人員培訓(xùn)、試

14、劑質(zhì)量,,（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證 分析前因素：標(biāo)本采集、運(yùn)送、穩(wěn)定化處理、貯存 分析中因素：核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增反應(yīng)、設(shè)置 對(duì)照系統(tǒng)（包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照等） 分析后因素：報(bào)告形式、反饋的信息等,第二節(jié) 以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù),,以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù),逆轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)定量PCR (quantitative PCR )

15、多重PCR (multiplex PCR) 免疫PCR差異顯示PCR (differential display PCR, DD-PCR)PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變?cè)籔CR (in situ PCR),一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）,以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)。主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探針，檢測(cè)RNA病毒、分析基因表達(dá)等,,逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式：以隨機(jī)進(jìn)行的PCR擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)

16、錄反應(yīng)的引物以oligo(dT)作為引物， mRNA3`末端polyA尾與之互補(bǔ)以人工合成的隨機(jī)序列六核苷酸混合物作為引物，進(jìn)行擴(kuò)增,二、定量PCR,對(duì)DNA或RNA樣本的靶序列進(jìn)行定量分析。主要用于基因表達(dá)的分析、病原體核酸的檢測(cè)等在定量PCR反應(yīng)體系中，除了常規(guī)PCR反應(yīng)所需的材料和試劑外，還必須引入內(nèi)參照系統(tǒng)。內(nèi)參照系統(tǒng)一般選用與待測(cè)序列結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)的基因常用的內(nèi)參照基因是?-肌球蛋白基因,,絕對(duì)定量 PCR外參照系統(tǒng)的

17、設(shè)置內(nèi)參照系統(tǒng)的設(shè)置,實(shí)時(shí)定量 PCR 對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行直接和動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)， 實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的實(shí)時(shí)定量分析,,熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又稱實(shí)時(shí)PCR，是目前較精確的進(jìn)行定量檢測(cè)PCR的方法FQ-PCR通過(guò)熒光信號(hào)對(duì)PCR過(guò)程中產(chǎn)物量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，精確計(jì)算出PCR的初始模板量,,熒光信號(hào)的檢測(cè)方法：1、DNA結(jié)合染料技術(shù)2、水解探針技術(shù)（TaqMan

18、 probe）技術(shù)3、雜交探針技術(shù),TaqManTM,d.NTPs,Thermal Stable DNA Polymerase,Primers,Add Master Mix and Sample,Denaturation,,Annealing,Reaction Tube,l,,TaqManTM,,Extension Step,1. Strand Displacement,2. Cleavage,3. Polymerization

19、Complete,4. Detection,l,,,,實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)CEA基因拷貝數(shù)在監(jiān)測(cè)胃腸癌微轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用,,CEA 基因在消化系統(tǒng)上皮腺癌， 尤其是直結(jié)腸癌和胃癌中高表達(dá)， 因此在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到其轉(zhuǎn) 錄本，而在正常成人體內(nèi)極少表 達(dá)。,正常成人體內(nèi)CEA基因表達(dá),,胃腸癌腫瘤組織中CEA基因的表達(dá),在腫瘤發(fā)生血道轉(zhuǎn)移時(shí)，外周血 中有少量腫瘤細(xì)胞殘留。用靈敏、

20、特異的技術(shù)檢測(cè)到這些腫瘤細(xì)胞 中CEA基因的轉(zhuǎn)錄本，是發(fā)現(xiàn)腫 瘤早期轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。,胃腸癌患者外周血中CEA基因的表達(dá),三、多重PCR,在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣本中多個(gè)不同序列的靶片段。,DMD基因外顯子缺失的檢測(cè),四、差異顯示PCR（differential display PCR,DD-PCR）,一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達(dá)差異的技術(shù)。DD-PCR主要用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳

21、學(xué)研究，是目前篩選基因表達(dá)差異最有效的方法。,差異顯示RT-PCR(Differential display RT-PCR),第三節(jié) 點(diǎn)突變的檢測(cè)技術(shù),,,PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP） 等位基因特異性寡核苷酸 （allele specific oligonucleotide, ASO）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism, SSCP）

22、 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 融點(diǎn)曲線分析（melting curve analysis）PCR產(chǎn)物的序列分析,點(diǎn)突變,一、 已知點(diǎn)突變的檢測(cè)方法 1.PCR-RFLP 利用正常序列或突變序列是否處于限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)而設(shè)計(jì)。若點(diǎn)突變處于某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)內(nèi)，可在突變點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，使PCR產(chǎn)物含有該突變序列。用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)正常產(chǎn)物和突變產(chǎn)物進(jìn)行水解并作電泳分離，可根據(jù)水解片段的大小和電

23、泳位置區(qū)分二者。,Bcl I RFLP（血友病A）,2.等位基因特異性寡核苷酸雜交,被檢基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)移到膜上，分別與長(zhǎng)度為15~20bp、經(jīng)標(biāo)記的正常序列和突變序列的寡核苷酸探針雜交。由于20個(gè)堿基中僅一個(gè)堿基差異即可使DNA分子的Tm值下降 5~7.5℃，因此通過(guò)嚴(yán)格控制雜交條件，可使PCR產(chǎn)物僅與完全互補(bǔ)的探針雜交，根據(jù)有無(wú)雜交信號(hào)即可判斷被檢者的擴(kuò)增片段中是否帶有突變點(diǎn)。,3.DNA芯片技術(shù)（DNA chip）,在固相支

24、持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龍膜等）表面有序地陣列一系列固定于一定位置的分子（探針），當(dāng)標(biāo)記樣品（如用化學(xué)熒光法、化學(xué)發(fā)光法標(biāo)記）與探針進(jìn)行雜交后，用共聚焦熒光自動(dòng)掃描等技術(shù)獲取信息，經(jīng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)處理、分析后得到結(jié)果。,s,4. Southern印跡雜交,二、未知點(diǎn)突變的檢測(cè)方法,1. 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformational polymorphism，SSCP） 突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)

25、變性后產(chǎn)生兩條與正常 DNA構(gòu)象不同的單鏈，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電 泳時(shí)，不同構(gòu)象的片段顯示不同的電泳遷移率，從 而能區(qū)別正常與突變的DNA。SSCP只適用于檢測(cè) 150~200bp長(zhǎng)度的DNA片段。,2. 變性梯度凝膠電泳（DGGE）,利用不同序列的DNA分子具有不同的融點(diǎn)溫度(Tm)的特性。設(shè)計(jì)引物時(shí)使被擴(kuò)增的目的片段含有2個(gè)不同的區(qū)域，一個(gè)Tm較高，另一個(gè)較低，將該P(yáng)CR產(chǎn)物在由變性劑形成的梯度凝膠上進(jìn)行

26、電泳，由于正常序列的PCR產(chǎn)物與突變的 PCR 產(chǎn)物的Tm不同，在電泳過(guò)程中Tm較低的區(qū)域被部分解鏈的先后不同，造成電泳遷移率的變化也不同，最后在凝膠中所處的電泳位置也不同，據(jù)此可以區(qū)別正常片段與突變片段。,3.異源雙鏈分析（heteroduplex analysis，HA）,正常DNA和突變DNA在一起變性后再緩慢復(fù)性，可使兩者互補(bǔ)形成異源雜合雙鏈，并在錯(cuò)配處形成一個(gè)凸起。在非變性凝膠電泳時(shí)，異源雙鏈片段會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈片段不

27、同的遷移率，從而使二者分開(kāi)。,4. 熔點(diǎn)曲線分析(melting curve analysis）,DNA片段中突變堿基與正常堿基不能配對(duì)而形成異源雙鏈，所產(chǎn)生的Tm較完全配對(duì)的同源雙鏈的Tm低，在儀器上顯示出不同的曲線從而將突變序列檢測(cè)出來(lái)。所需儀器如高效液相色譜儀(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系統(tǒng)、LightCycler等。,5.DNA序列分析（DNA sequencing）,Sanger測(cè)序技術(shù)： 以待測(cè)序列的單鏈

28、DNA作為模板，加入一個(gè)引物和dNTP作為底物，并加入一定比例的2’，3’-ddNTP，在DNA聚合酶的作用過(guò)程中，正常dNTP的摻入使鏈延伸，若ddNTP的摻入則使鏈終止，這樣就可以得到一系列長(zhǎng)度不同的以四種ddNTP結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)電泳后可直接讀出堿基序列。,PCR測(cè)序演示版,,,1,2,第四節(jié) PCR技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用,,PCR技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用,感染性疾病中病原微生物核酸的檢測(cè)單基因遺傳性疾病的基因診斷多基因病相