抗甲醛真菌AnYAP1基因的克隆及其功能研究.pdf

1、裝修帶來(lái)的室內(nèi)甲醛污染是影響人們身體健康的“隱形殺手”，其凈化是當(dāng)務(wù)之急。許多生物都具有高效吸收和代謝甲醛的能力，其中真菌不僅能代謝甲醛，而且還能夠耐受較高程度的甲醛脅迫。但其基因資源并未得到有效地開發(fā)和利用。YAP1是一類b-ZIP型激活蛋白，有報(bào)道指出在畢赤酵母的甲醇代謝過(guò)程中PpYAP1能夠通過(guò)激活谷胱甘肽氧化還原反應(yīng)來(lái)代謝甲醛和清除ROS。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究工作中，分離得到了抗甲醛真菌菌株(Aspergillus nomius

2、SGFA1)。本研究從中克隆得到了AnYAP1基因，構(gòu)建其植物表達(dá)載體，對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。研究轉(zhuǎn)錄因子YAP1在甲醛代謝方面的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1.AnYAP1基因的克隆與序列分析
　　利用RT-PCR的方法從真菌中克隆獲得An YAP1基因。序列分析結(jié)果顯示，AnYAP1基因全長(zhǎng)1752bp，編碼584個(gè)氨基酸，含有BRLZ和PAP1結(jié)構(gòu)域，屬于bZIP家族。將Aspergillus nomius SGFA1

3、AnYAP1氨基酸序列在NCBI中Blast分析后發(fā)現(xiàn)與曲霉菌Aspergillus bombycis氨基酸具有較高相似性，與曲酶菌AbYAP1氨基酸差異位點(diǎn)共有16個(gè)，其中PAP1結(jié)構(gòu)域內(nèi)的差異位點(diǎn)有8個(gè)，BRLZ結(jié)構(gòu)域內(nèi)的差異位點(diǎn)有1個(gè)，其他位置有7個(gè)。分子系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，Aspergillus nomius SGFA1AnYAP1與曲霉菌Ab YAP1的親緣關(guān)系最近。
　　2.AnYAP1基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植

4、株的分子鑒定
　　構(gòu)建了pCBM-AnYAP1植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)模式植物煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。利用草丁膦進(jìn)行篩選，將長(zhǎng)出的不定芽挪入篩選生根培養(yǎng)基后，共獲得生根的抗性煙草植株48株。再對(duì)抗性煙草植株進(jìn)行分子鑒定(PCR和qRT-PCR)，鑒定結(jié)果獲得了煙草陽(yáng)性苗13株，其中1、5、9號(hào)株系中目的基因的表達(dá)量較高。
　　3.轉(zhuǎn)AnYAP1基因煙草的功能分析
　　對(duì)表達(dá)量較高的三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行甲醛抗性功能分析，

5、轉(zhuǎn)基因煙草在含4mM甲醛的固體培養(yǎng)基上能夠保持綠色正常生長(zhǎng)，而野生型全部都白化死亡。4mM氣體甲醛處理12天后，轉(zhuǎn)基因煙草的表型損傷明顯低于野生型。轉(zhuǎn)基因煙草種子能在含1500mg L-1甲醛的培養(yǎng)基上正常萌發(fā)生長(zhǎng)，而野生型煙草僅部分萌發(fā)且不能成活。對(duì)甲醛脅迫下煙草的一系列生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明轉(zhuǎn)入An YAP1基因的煙草呈現(xiàn)出了更好的甲醛抗性。具體表現(xiàn)為在同濃度甲醛脅迫下的轉(zhuǎn)基因與野生型煙草葉片，前者的總?cè)~綠素含量、可溶性蛋白以及

6、可溶性糖的含量均顯著高于后者。且在同濃度甲醛脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草的氧化損傷指標(biāo)包括丙二醛、過(guò)氧化氫以及超氧陰離子的含量明顯低于野生型。結(jié)果表明AnYAP1基因降低了植株的氧化損傷程度。轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)活性，在甲醛脅迫下均顯著高于野生型。在液態(tài)甲醛吸收能力分析的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因煙草的甲醛代謝能力是野生型的2.77-2.92倍。氣態(tài)甲醛吸收能力分析的結(jié)果，轉(zhuǎn)基因煙草代謝氣體甲醛的能力是野生型的2.287-4.4