家蠶30K蛋白基因的克隆表達(dá)及其抗凋亡功能研究.pdf

1、家蠶30K載脂蛋白是家蠶幼蟲血淋巴中主要的一群低密度脂蛋白，除載脂功能，還具有較強(qiáng)的抑制昆蟲和哺乳動物細(xì)胞凋亡的活性。體內(nèi)高血脂和自由基的堆積均可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，從而引起其功能發(fā)生異常。血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在動脈粥樣硬化形成過程中具有至關(guān)重要的作用。由于家蠶30K蛋白兼具載脂功能和抗細(xì)胞凋亡的活性，推測其可能具有抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。因此，研究家蠶30K蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中的作用極可能具有重要意

2、義，進(jìn)而可通過探索其藥用價值，為防治和治療動脈粥樣硬化疾病提供新途徑、新基礎(chǔ)。
　　 家蠶30K蛋白基因在進(jìn)化過程中產(chǎn)生很多種基因，編碼的蛋白均具有相似的結(jié)構(gòu)。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)工具，根據(jù)已報道的具有抗細(xì)胞凋亡功能的家蠶30K蛋白基因BmLp-c6（GenBank登錄號:X54735）編碼的氨基酸序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對分析，獲得兩個與BmLp-c6同源性較高的家蠶30K蛋白其基因序列分別為Bm

3、Lip-19G1(GenBank登錄號:AY568957)和BmLp-C12p(GenBank登錄號:NM_001101728)。然后利用RT-PCR技術(shù)從家蠶蛹中克隆了上述三條家蠶30K蛋白基因，并在家蠶Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行大量融合表達(dá)、純化。表達(dá)產(chǎn)物純化后經(jīng)SDS-PAGE可檢測到純度較高的、分子量大小約為30kD的目的蛋白條帶。Western blotting分析結(jié)果顯示3種目的蛋白與融合表達(dá)標(biāo)簽6×His-

4、tag單克隆抗體具有良好的特異性反應(yīng)。
　　 利用自建的H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的體外損傷及凋亡模型，研究家蠶30K蛋白對H2O2誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的保護(hù)作用。MTT法檢測結(jié)果顯示:3種30K蛋白均可一定程度上增強(qiáng)HUVEC細(xì)胞的活力。對胞內(nèi)8-異前列腺素F2a（8-Isoprostane）（氧化應(yīng)激標(biāo)志物）濃度檢測結(jié)果顯示:利用H2O2處理HUVEC，可明顯增加胞內(nèi)8-isoprostane的濃度，而3種3

5、0K蛋白均可顯著降低胞內(nèi)8-isoprostane的濃度，表明3種30K蛋白均可通過降低細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激程度從而保護(hù)HUVEC。DNA片段化ELISA檢測結(jié)果顯示:3種30K蛋白均可降低HUVEC胞內(nèi)DNA片段化程度，表明3種30K蛋白對H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的凋亡均具有一定的抑制作用。流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果也顯示:3種30K蛋白均具有不同程度的降低HUVEC凋亡率的作用。綜上所述，3種家蠶30K蛋白均可通過抑制H2O2誘導(dǎo)的