微束激光介導(dǎo)抗真菌基因轉(zhuǎn)化棉花的研究及抗蚜基因的克隆.pdf

1、棉花是我國主要的經(jīng)濟(jì)作物，在國民經(jīng)濟(jì)中具有重要地位。黃萎病是對(duì)棉花生產(chǎn)危害最大的世界性病害之一，嚴(yán)重影響了棉花的產(chǎn)量及棉纖維的品質(zhì)。常規(guī)育種方法因抗源缺乏很難培育出抗黃萎病的棉花新品種。本研究用基因工程手段，將激光微束穿刺技術(shù)與種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化法結(jié)合，成功地將幾丁質(zhì)酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因?qū)朊藁ㄖ校⒆罱K得到了幾丁質(zhì)酶基因整合的轉(zhuǎn)基因植株。 轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是利用Nd：YAG三倍頻的微束激光，激光波長為0.35μm，輸出能量10m

2、J，在12.5倍物鏡聚焦于欲照射的細(xì)胞，光斑直徑為4.02μm。進(jìn)行激光微束穿刺導(dǎo)入幾丁質(zhì)酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因的雙價(jià)植物表達(dá)載體。分別以棉花感受態(tài)萌動(dòng)種胚和授粉后40-50天的幼胚為受體，將材料預(yù)培養(yǎng)48h后再進(jìn)行預(yù)高滲處理2h，外源質(zhì)粒濃度為0.1mg/ml，轉(zhuǎn)化后進(jìn)行卡那霉素梯度篩選，將移栽成活的棉花進(jìn)行總DNA的PCR擴(kuò)增，有一株同時(shí)擴(kuò)增到了幾丁質(zhì)酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因的特異片段，另外有四株分別得到了β-1，

3、3-葡聚糖酶基因和幾丁質(zhì)酶基因的特異片段。對(duì)卡那霉素有抗性植株的T1代進(jìn)行盆栽檢測(cè)，30株中表現(xiàn)卡那霉素抗性的植株有10株，其中8株在幾丁質(zhì)酶基因的檢測(cè)中表現(xiàn)出陽性，但相同植株在β-1，3-葡聚糖酶基因的檢測(cè)時(shí)無目的條帶出現(xiàn)。 本研究還克隆了植物凝集素基因，以解決棉花蚜蟲的危害問題，蚜蟲屬同翅目昆蟲，通過吸取植物韌皮部的汁液造成直接危害，又通過傳播植物病害對(duì)植物造成間接危害，植物凝集素是一類具有特異糖結(jié)合活性的蛋白，在植物基因工

4、程中具有較大的應(yīng)用潛力。反枝莧(AmaranthusretroflexusL.)生于農(nóng)田、路邊，適應(yīng)性極強(qiáng)，對(duì)高等動(dòng)物無毒害。莧菜凝集素基因(ARA)全長2453bp，含有一個(gè)1538bp的內(nèi)含子和兩個(gè)分別為212bp和703bp的外顯子，通過重疊序列設(shè)計(jì)的引物與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，獲得了該基因的915bp編碼區(qū)克隆片段，避免了通過mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA而帶來的一系列問題，序列分析表明反枝莧凝集素基因與文獻(xiàn)報(bào)道來自千穗谷莧菜

5、的AHA基因序列有98.8％的同源性。同時(shí)設(shè)計(jì)特異引物，采用PCR擴(kuò)增的方法，從質(zhì)粒pBIBGC中克隆到維管束特異表達(dá)BSP基因啟動(dòng)子的功能片段，其序列大小為840bp，其中富含A/T的區(qū)域和富含A/T的重復(fù)序列，通過序列比對(duì)分析與已報(bào)道的序列同源性達(dá)98.2％。 將ARA基因插入到微生物表達(dá)載體pET28a的T7啟動(dòng)子和終止子之間，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，得到了36.0kDa的特異蛋白條帶