鱖caveolin-1基因的克隆及其功能研究.pdf

1、胞膜窖(Caveolae)是一種富含膽固醇、鞘糖脂和鞘磷脂等物質的結構性細胞器，普遍存在于哺乳動物中細胞膜上。窖蛋白(Caveolin-1)是胞膜窖的主要組成蛋白，隨著分子生物學研究的進展，發(fā)現其參與了許多細胞生命活動，例如細胞內吞(endocytosis)、膽固醇運輸、細胞膜組裝、信號傳導和腫瘤生成等。
　　 本文通過簡并PCR、RACE等技術獲得鱖魚(Siniperca chuatsi)中的caveolin-1(mCav-1

2、)的全長cDNA序列。mCav-1蛋白與哺乳動物中的caveolin-1蛋白有著相似的蛋白結構域：caveolin的標志性肽段(FEDVIAEP)、腳手架區(qū)(CSD)、C端保守蛋白結構域。然而，在mCav-1上沒有發(fā)現第14位的酪氨酸磷酸化位點，而此磷酸化位點對于大部分物種的caveolin-1功能的發(fā)揮起著至關重要的作用。通過構建mCav-1的原核和真核表達載體進而制備mCav-1的多克隆抗體，免疫印跡結果顯示mCav-1蛋白的α和β

3、亞型均有表達，且其在鱖各個組織的表達情況與目前報道的其他脊椎動物基本一致。然而令人感興趣的是鱖脾臟中mCav-1表達量最高，與一般認為脾臟中胞膜窖含量少的結論不一致。通過免疫熒光及免疫印跡方法對mCav-1蛋白進行細胞定位，證明其的確是分布于細胞膜上的胞膜窖上，但細胞通過MβCD、filipinⅢ或naystatin等能結合膽固醇或去除膽固醇的藥物處理后，mCav-1蛋白的定位會發(fā)生變化。通過進一步研究發(fā)現，鱖魚細胞中mCav-1蛋白的

4、表達量隨著傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)感染時間的增加呈上升趨勢，Far-Western結果表明ISKNV上可能存在著跟mCav-1特異性相結合的蛋白。Cavelin-1的腳手架區(qū)是其與其它信號分子相互作用位點，本研究設計并人工合成了能特異性結合mCav-1腳手架區(qū)結合的多肽，定量PCR等實驗結果顯示其不但能抑制細胞脂類的運輸，而且可以抑制poly(I∶C)誘導的Jak-Stat信號通路。本文通過實驗證明了mCav-1蛋白定位于胞膜窖