T4溶菌酶基因的遺傳轉(zhuǎn)化及作為選擇標(biāo)記基因的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、T4溶菌酶是目前發(fā)現(xiàn)活性最高的溶菌酶,可以同時裂解革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌,還可以通過一種非酶機(jī)制使病毒失活,抑制真菌游動孢子、分生孢子的萌發(fā)和菌絲的伸長,是一種高效的廣譜抗菌劑。本研究克隆得到T4溶菌酶基因全長,并成功地將T4溶菌酶基因插入到表達(dá)載體pCambia1304中,得到含目的基因的表達(dá)載體pCT4。
  本研究首先建立了泡桐C125葉片的高效再生和農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。所建立的再生體系中最佳的芽分化誘

2、導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+12mg/L6-BA+0.6 mg/L NAA,最佳生根培養(yǎng)基為:MS+2.5mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+0.15 mg/L IBA。最佳的遺傳轉(zhuǎn)化體系為:農(nóng)桿菌濃度為OD600=0.2,侵染時間為3min,暗培養(yǎng)4天,最適脫菌劑Cef濃度為600mg/L,葉片對Hyg適宜的選擇壓力濃度為8mg/L。
  本研究以根癌農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)表達(dá)載體pCT4轉(zhuǎn)化泡桐C125葉片,對經(jīng)過篩選后的再生植株

3、進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)和GUS組織活性檢測,得到了3株轉(zhuǎn)基因植株,轉(zhuǎn)化率為20%。以所得3株轉(zhuǎn)基因植株無性系為砧木,泡桐叢枝病苗為接穗進(jìn)行了嫁接轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),經(jīng)過一個月培養(yǎng)后,觀察到不同抗性程度和不同表型的嫁接苗。對嫁接苗進(jìn)行植原體16SrRNA基因保守序列片段的PCR擴(kuò)增試驗(yàn),都檢測到1.5kb大小的特異性條帶,證明3個轉(zhuǎn)基因植株無性系都嫁接成功。
  本研究以根癌農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)表達(dá)載體pCT4和陽性對照表達(dá)載體pCambia1

4、304轉(zhuǎn)化煙草、楊樹和紅豆杉愈傷組織TM3,轉(zhuǎn)化和再生過程中均不使用抑制農(nóng)桿菌的氨芐青霉素和篩選抗生素潮霉素B,結(jié)果表明:3個轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中陽性對照葉片或愈傷組織由于農(nóng)桿菌的抑制作用,最后都黃化、褐化甚至死亡;3個轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組(表達(dá)載體pCT4)的葉片在長滿農(nóng)桿菌的情況下都分化出再生芽,紅豆杉愈傷組織TM3存在一定程度上的褐化現(xiàn)象,但與陽性對照相比較輕微。進(jìn)一步將轉(zhuǎn)化T4溶菌酶基因的煙草試驗(yàn)組分化的再生植株提取DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)

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