GLP-1高效表達(dá)型螺旋藻的構(gòu)建及其應(yīng)用技術(shù)研究.pdf

1、糖尿病是嚴(yán)重威脅人類健康的慢性代謝疾病。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）具有降低血糖、恢復(fù)胰島功能、提高外周組織對胰島素敏感性等諸多功能，是新一代理想的糖尿病治療藥物。本實驗室根據(jù)天然GLP-1結(jié)構(gòu)，改造其編碼序列構(gòu)建了可以抵抗人體內(nèi)DPP-Ⅳ切割的口服長效促胰島素rolGLP-1。
　　 本研究采用轉(zhuǎn)座和同源重組兩種策略----基于Tn5轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座策略和基于rDNA重組的同源重組策略，構(gòu)建整合型表達(dá)10拷貝rolGLP-1的

2、鈍頂螺旋藻株系，為開發(fā)降糖螺旋藻口服藥物奠定基礎(chǔ)。通過反向PCR技術(shù)去除自殺性質(zhì)粒pSZ21上Tn5轉(zhuǎn)座子序列中的抗性基因序列。得到質(zhì)粒p21GZ。經(jīng)多次酶切連接構(gòu)建篩選標(biāo)記GFP、螺旋藻特異啟動子AP、10拷貝rolGLP-1及T7終止子串聯(lián)構(gòu)成的GAG表達(dá)單元。將GAG表達(dá)單元插入p21 GZ上Tn5左臂原卡那霉素抗性基因啟動子下游，構(gòu)建載體p21GZ-GAG。將鈍頂螺旋藻培養(yǎng)至指數(shù)生長階段，通過添加EDTA以抑制鈍頂螺旋藻中的內(nèi)切

3、酶活性。通過300w，70s的超聲處理獲得1～6個細(xì)胞的螺旋藻原生質(zhì)體。隨后用質(zhì)粒p21GZ-GAG對螺旋藻進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化采用了冰浴轉(zhuǎn)化法、PEG轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法多種方法。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物接入96孔板培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察，多次重復(fù)試驗未觀察到發(fā)出綠色熒光的轉(zhuǎn)化株。改變Mg2+濃度、轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)時間、轉(zhuǎn)化方法和參數(shù)后目前尚未檢測到轉(zhuǎn)化株。通過定點突變消除GAG表達(dá)單元中的BamHI酶切位點，得到mGAG表達(dá)單元。再用PCR方法在mGAG表達(dá)單元兩