鹽生杜氏藻錳超氧化物歧化酶（MnSOD）的基因克隆、表達(dá)與功能研究.pdf

1、超氧化物歧化酶(SOD)是一種能催化超氧自由基(O<'2->)發(fā)生歧化反應(yīng)的金屬酶。由于超氧自由基(O<'2->)被認(rèn)為對(duì)各種生物大分子及其它細(xì)胞組分具有嚴(yán)重的損傷作用，因此SOD被認(rèn)為是體內(nèi)對(duì)抗自由基的第一道防線，其分子生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用研究備受關(guān)注。按照結(jié)合金屬離子種類(lèi)不同，目前已知的SOD主要有以下三種，即Fe-SOD,Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。其中，Mn-SOD多為誘導(dǎo)表達(dá)型，氧自由基對(duì)Mn-SOD的表達(dá)有顯著的誘導(dǎo)作用。

2、因此，Mn-SOD在機(jī)體適應(yīng)環(huán)境變化，尤其在應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫方面可能發(fā)揮重要作用。 鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)是高耐鹽性的單細(xì)胞真核綠藻，能在含飽和的NaCl培養(yǎng)液中生存，而且能夠在紫外輻射極強(qiáng)的青藏高原生存，具有較高的耐紫外線特性。通過(guò)比較幾種藍(lán)、綠藻粗酶液中的SOD，發(fā)現(xiàn)鹽藻Mn.SOD的比活性高達(dá)105.3U/m g，是螺旋藻的十幾倍，這在一般的藻類(lèi)中是不多見(jiàn)的。本實(shí)驗(yàn)對(duì)鹽藻體內(nèi)MnSOD活性與外界脅迫的

3、關(guān)系做了研究，發(fā)現(xiàn)在不同的鹽脅迫、紫外脅迫和溫度脅迫下，鹽藻體內(nèi)MnSOD活性與脅迫強(qiáng)度呈正相關(guān)。因此我們推測(cè)：杜氏鹽藻抗逆機(jī)制與MnSOD存在著聯(lián)系，鹽藻在耐鹽堿以及耐輻射能力上與其他物種巨大的差異很可能與鹽藻MnSOD的自身特性相關(guān)，比如含量的多少，酶活性質(zhì)等，除此之外，也可能與基因在在受誘導(dǎo)后的表達(dá)量有關(guān)。因此，研究鹽生杜氏藻MnSOD基因及其蛋白功能夠幫助揭示鹽藻獨(dú)特的耐鹽等機(jī)理。 為了解決上述問(wèn)題，本文開(kāi)展了以下內(nèi)容的

4、研究： 一、鹽生杜氏藻MnSOD與鹽、堿及紫外脅追聯(lián)系的生理實(shí)驗(yàn)。針對(duì)鹽藻耐鹽、堿和抗紫外的特點(diǎn)，通過(guò)在鹽、堿和紫外脅迫環(huán)境下測(cè)定鹽藻粗酶中MnSOD的酶活，得出鹽藻MnSOD活性與鹽、堿和紫外脅迫條件呈正相關(guān)的結(jié)果，初步證實(shí)鹽藻MnSOD具有與抗逆相關(guān)的特性，為立題提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 二、克隆鹽生杜氏藻MnSOD基因的cDNA全長(zhǎng)。通過(guò)同源克隆的方法，首先成功的克隆到鹽生杜氏藻MnSOD基因的一段EST序列，接著通

5、過(guò)5’RACE和3’RACE技術(shù)，獲得了其全長(zhǎng)cDNA序列，命名為DsMnSOD。 三、對(duì)杜氏鹽藻MnSOD基因及其推演出的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)鹽藻MnSOD蛋白與大多數(shù)．MnSOD蛋白在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上的相同之處，進(jìn)一步證實(shí)了MnSOD是一類(lèi)比較保守的蛋白。 四、通過(guò)功能互補(bǔ)研究，證實(shí)了MnSOD蛋白在杜氏鹽藻耐鹽、抗紫外、抗寒和抗氧脅迫方面具有貢獻(xiàn)。通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體pET32a-Mnsod，轉(zhuǎn)入大腸桿

6、菌SOD突變株K12，檢測(cè)蛋白在不同脅迫條件下對(duì)菌株的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，鹽藻MnSOD具有抗逆功能，特別是其耐鹽和抗紫外功能突出，與杜氏鹽藻自身的抗逆特點(diǎn)相同，更加說(shuō)明MnSOD在鹽藻抗逆機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。 五、建立起DsMnSOD基因的原核表達(dá)體系，得到純化的融合蛋白，測(cè)定并分析其生理生化屬性，發(fā)現(xiàn)蛋白具有金屬酶特性，受Mn<'2+>調(diào)控表達(dá)，具有廣泛的pH耐受范圍(pH4～11)和較好的溫度耐受能力(在85℃水浴中酶活