重組游仆蟲(chóng)核糖體蛋白L11與肽鏈釋放因子體外相互作用的分析.pdf

1、蛋白質(zhì)合成是細(xì)胞內(nèi)最重要的生命活動(dòng)之一，這一過(guò)程包括核糖體上新生肽鏈合成的起始、延伸和終止。核糖體蛋白L11(ribosome protein L11)是一種高度保守的蛋白質(zhì)，是蛋白質(zhì)合成過(guò)程中的幾個(gè)步驟所必需的。核糖體蛋白L11由N-末端和C-末端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。研究表明，L11的N-末端在蛋白質(zhì)合成中作為分子開(kāi)關(guān)，在多肽鏈的延伸階段與EF-G相互作用對(duì)EF-G依賴(lài)的遷移過(guò)程是必需的。在肽鏈終止階段與RF1(肽鏈釋放因子)相互作用對(duì)R

2、F1識(shí)別終止密碼子UAG的功能是必需的。L11上包含有一個(gè)與具有噻唑抗性的抗生素結(jié)合的靶位點(diǎn)，這種結(jié)合會(huì)抑制依賴(lài)延伸因子的核糖體的活性，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的功能以及相關(guān)的反應(yīng)也是相當(dāng)重要的。
　　本研究從八肋游仆蟲(chóng)（Euplotes octocarinatus）大核基因組中克隆到核糖體蛋白L11基因，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1-L11，通過(guò)谷胱甘肽-Sepharose4B親和層析，純化了重組融合蛋白GST-L11。利用獲得的

3、目的蛋白制備了多克隆抗體。并研究了游仆蟲(chóng)的核糖體蛋白L11與第一類(lèi)肽鏈釋放因子eRF1a的體外相互作用。本研究的主要進(jìn)展如下:
　　本研究根據(jù)已知的核糖體蛋白L11保守氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增克隆了該游仆蟲(chóng)的核糖體蛋白基因片段，并對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行了分析。根據(jù)測(cè)得的序列設(shè)計(jì)特異性引物，并利用游仆蟲(chóng)的端粒序列（C4A4C4A4C4A4C4）為引物，擴(kuò)增得到基因的全序列。序列分析表明，該基因全長(zhǎng)為709bp，編碼區(qū)由531bp組成，編

4、碼176個(gè)氨基酸，不含內(nèi)含子。該基因在GenBank登陸號(hào)為EF061066。
　　將游仆蟲(chóng)的核糖體蛋白L11基因構(gòu)建于原核表達(dá)載體pGEX-6p-1中，得到的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1-L11轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合蛋白GST-L11。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)谷胱甘肽-Sepharose4B親和層析得到了純化。Western blot分析表明該蛋白為融合有GST的L11蛋白。
　　通過(guò)酶切的方

5、法將融合蛋白的GST標(biāo)簽切除，得到純化的目的蛋白L11。采用切膠回收的方法回收目的蛋白，并將回收產(chǎn)物免疫大鼠，制備抗體，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)1∶8，000。Western blot檢測(cè)證明抗體特異性良好。該多克隆抗體為進(jìn)一步研究核糖體蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　分別將游仆蟲(chóng)核糖體蛋白的融合蛋白GST-L11與第一類(lèi)肽鏈釋放因子的融合蛋白His-eRF1a在體外進(jìn)行表達(dá)，并利用其中一個(gè)蛋白與其相應(yīng)的特異性親和層析作用，進(jìn)行Pul