八肋游仆蟲cDNA文庫(kù)構(gòu)建及肽鏈釋放因子互作蛋白的初步篩選.pdf

1、蛋白質(zhì)合成過(guò)程是一個(gè)開放的系統(tǒng)，其中多種因子與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成過(guò)程，維持細(xì)胞內(nèi)所有生命過(guò)程的有序進(jìn)行，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)有一系列蛋白質(zhì)包括一些酶參與蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)，形成了復(fù)雜的mRNA代謝和蛋白質(zhì)合成的網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。酵母雙雜交文庫(kù)是篩選與目的蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)的一種非常有效的方法。利用該方法已經(jīng)篩選得到了許多相互作用的目的蛋白質(zhì)，為研究細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了極為有效的工具。
　　蛋白質(zhì)

2、的合成過(guò)程包括核糖體上肽鏈合成的起始、延伸和新生肽鏈的釋放。肽鏈釋放因子不僅在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成終止過(guò)程中起作用，而且在其它方面也起到重要作用，表現(xiàn)出多功能蛋白質(zhì)的特征。
　　原生動(dòng)物八肋游仆蟲是一類單細(xì)胞真核生物，其密碼子使用存在特殊性:終止密碼子UGA在該生物體中編碼半胱氨酸。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道纖毛蟲中八肋游仆蟲的閱讀框中終止密碼子(UGA)出現(xiàn)的頻率最低，其mRNA最有效的被翻譯成了高分子量的連續(xù)的多肽鏈，這一結(jié)果為首次纖毛蟲酵母

3、雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建提供了重要依據(jù)。
　　本研究以八肋游仆蟲為材料，提取總RNA，用mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA構(gòu)建酵母雙雜交文庫(kù)，用蛋白質(zhì)合成終止過(guò)程中負(fù)責(zé)新生肽鏈釋放的兩類肽鏈釋放因子作為誘餌蛋白，篩選與其相互作用的蛋白質(zhì)，獲得了以下主要結(jié)果:
　　提取了八肋游仆蟲總RNA，瓊脂糖凝膠電泳中28S rRNA條帶顯示得到了較為理想的提取物;利用clontech公司的BD MatchmakerTM Library Contruc

4、tion&Screening kit試劑盒，將得到的總RNA中的mRNA利用兩步法合成ds cDNA，通過(guò)純化、富集、再純化得到了與對(duì)照相比豐度比較適合的cDNA;用PCR方法對(duì)得到的cDNA進(jìn)行了鑒定，結(jié)果擴(kuò)增到已知的基因。將得到的cDNA與用SmaⅠ單酶切處理的文庫(kù)質(zhì)粒pGADT7-Rec混合，轉(zhuǎn)化接合酵母菌AH109，涂板培養(yǎng)，收集克隆;最后分析文庫(kù)滴度為2.437×107cfu/mL，文庫(kù)構(gòu)建基本完成，隨后隨機(jī)提取文庫(kù)中的質(zhì)粒，

5、用質(zhì)粒pGADT7-Rec上的測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序分析，證明在質(zhì)粒中重組了八肋游仆蟲的基因片段。
　　以蛋白質(zhì)合成終止過(guò)程中的兩類肽鏈釋放因子之一eRF3作為誘餌蛋白基因，利用酵母雙雜交的方法從游仆蟲cDNA文庫(kù)中篩選與誘餌蛋白基因相互作用的蛋白基因。獲得以下結(jié)果:1）構(gòu)建了含誘餌蛋白基因的重組質(zhì)粒pGBKT7-eRF3，將其轉(zhuǎn)化到接合菌Y187中，對(duì)Y187/pGBKT7-eRF3菌株進(jìn)行了鑒定，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行擴(kuò)增，將得

6、到的質(zhì)粒進(jìn)行分析和測(cè)序，結(jié)果表明成功構(gòu)建了含有融合誘餌蛋白重組基因的目的菌株;2）文庫(kù)菌和誘餌菌雜交，接合率大于2％;將接合后的菌液涂于SD/-Leu/-Trp/-His平板上進(jìn)行初級(jí)篩選，獲得了200個(gè)陽(yáng)性克隆;再將初級(jí)篩選得到的克隆涂于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade平板上進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)性篩選，獲得了36個(gè)克隆;重復(fù)嚴(yán)謹(jǐn)性篩選后得到22個(gè)克隆;最后用β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行鑒定，獲得16個(gè)陽(yáng)性克隆，一系列的篩選總率為8％。3）將

7、篩選出的陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用獲得的高拷貝質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定。測(cè)序結(jié)果表明，16個(gè)質(zhì)粒中6號(hào)和74號(hào)質(zhì)粒含有較長(zhǎng)的未知基因閱讀框核酸序列;BLAST比對(duì)結(jié)果顯示33號(hào)和105號(hào)與游仆蟲核糖體RNA的序列類似;其余測(cè)序結(jié)果與這四個(gè)序列基本相同。4）酵母雙雜交重復(fù)鑒定實(shí)驗(yàn)表明6號(hào)是陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明其編碼的蛋白質(zhì)在體內(nèi)與誘餌蛋白eRF3相互作用;74號(hào)結(jié)果呈陰性，需要再做體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。5）根據(jù)6號(hào)質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果設(shè)