八肋游仆蟲中編程性核糖體移碼基因的鑒定及其分子機制研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的合成是所有生物體中的基本生命過程。核糖體維持正確的讀框?qū)τ诘鞍踪|(zhì)的合成至關(guān)重要，一旦發(fā)生移碼，將會導(dǎo)致截短的或無義蛋白的生成，從而造成翻譯能量的損耗，加重細胞清除及質(zhì)控機制的負擔(dān)。然而，在某些特殊情況下，翻譯中的核糖體能夠在mRNA的特定位置，從起始的0讀框轉(zhuǎn)換到-1或+1讀框，然后繼續(xù)進行翻譯，這一過程被稱作編程性核糖體移碼（programmed ribosomal frameshifting，PRF）。PRF現(xiàn)象首次在病毒中

2、發(fā)現(xiàn)，隨后越來越多的證據(jù)表明該現(xiàn)象普遍存在于從細菌到真核生物等生命進化的各個分支。前期基于單個基因的研究顯示游仆蟲中具有高頻率的+1PRF現(xiàn)象。本研究對八肋游仆蟲（Euplotes octocarinatus）的大核基因組及轉(zhuǎn)錄組進行了測序分析，從基因組水平對這一特殊現(xiàn)象及其分子機制進行了深入探討。此外，還通過質(zhì)譜分析對預(yù)測的PRF基因加以驗證。所得結(jié)果如下:
　　1.利用Illumina測序平臺對八肋游仆蟲大核基因組進行測序，共

3、得到約11Gb原始數(shù)據(jù);將低質(zhì)量reads過濾后，采用meta-assembly的拼接策略進行基因組組裝，將組裝結(jié)果中來自于細菌基因組及線粒體基因組的污染DNA去除后，最終得到41，980條Contigs，其N50為2，947bp，其中包含雙端端粒的Contigs有29，413條;隨后采用三種方法對拼接結(jié)果的完整性進行評估，結(jié)果表明拼接結(jié)果基本完整，八肋游仆蟲大核基因組能夠編碼細胞營養(yǎng)生長階段所需的全部基因;最后，利用AUGUSTUS軟

4、件對大核基因組中的non-PRF Contigs進行基因的從頭預(yù)測，共預(yù)測出29，076個完整基因，其中90％的基因有RNA-Seq數(shù)據(jù)的支持。對每條微染色體所包含的基因個數(shù)進行了統(tǒng)計，結(jié)果顯示約83％的微染色體僅編碼一個基因;與其他纖毛蟲一樣，八肋游仆蟲非編碼區(qū)的AT含量比編碼區(qū)高。
　　2.利用二代測序技術(shù)，對生長階段的八肋游仆蟲轉(zhuǎn)錄組進行測序，共得到4.9Gb數(shù)據(jù)。采用兩種方法對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行組裝，比較后選擇Tophat&C

5、ufflinks的組裝結(jié)果進行后續(xù)分析，該方法共拼接出32，353條轉(zhuǎn)錄本，平均長度為1,300bp;基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用相似性搜索的策略，最終共預(yù)測出4，690個移碼位點，分布于3,866個編程性核糖體移碼基因中，其中+1PRF基因3，700個，+2/-1PRF基因166個。隨后通過跟其他游仆蟲進行同源序列比對，共鑒定出5個-1PRF基因;對移碼基因進行了Pfam結(jié)構(gòu)域注釋，KEGG信號通路注釋及GO功能注釋，注釋結(jié)果顯示游仆蟲中PR

6、F基因功能多樣，分布于多個信號通路及生物過程;利用GO信息，對移碼基因進行了功能富集分析，結(jié)果表明移碼基因顯著富集于多個生物過程，主要涉及到磷酸化、去磷酸化及依賴泛素的蛋白降解等過程。
　　3.對八肋游仆蟲的總蛋白進行了大規(guī)模質(zhì)譜分析，最終得到2，853種蛋白的肽段信息，其中253種為PRF蛋白;移碼位點被肽段覆蓋的基因有7個，全部為+1PRF基因，其中CUFF.27536.1的兩個+1位移碼位點均有肽段覆蓋。根據(jù)移碼位點肽段的氨

7、基酸序列信息，確定了游仆蟲中+1PRF基因的移碼發(fā)生在滑動序列中終止密碼子TAR(R=A or G)的T處;此外還有89個PRF基因的移碼位點上下游均有肽段覆蓋，包括82個+1PRF基因以及7個+2PRF基因，這些肽段為證明游仆蟲中的PRF現(xiàn)象提供了間接的蛋白證據(jù);根據(jù)肽段信息，結(jié)合多序列比對結(jié)果，我們推測八肋游仆蟲的+2位移碼過程中，核糖體跳過了滑動序列中終止密碼子TAR的TA兩個核苷酸。
　　4.對所有PRF基因移碼位點上下游

8、30bp的序列進行保守序列模體的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除滑動序列外，無其他保守序列元件;對滑動序列的分析結(jié)果顯示，約92％的移碼位點由AAA密碼子和緊隨其后的終止密碼子組成，其余8％由其他密碼子和終止密碼子構(gòu)成，移碼位點共包含47種有義密碼子;在+1PRF基因的滑動序列中XXX（三個核苷酸相同）類型的密碼子最多(97％)，而在+2PRF基因的滑動序列中XTA（X代表任意核苷酸）類型的密碼子最多(73％)，5個-1PRF基因中，有3個基因的滑動序

9、列為AAG TAA，其余兩個分別為TCT TAA和TTT TAA，其滑動序列下游未檢測到假結(jié)或莖環(huán)等刺激結(jié)構(gòu);此外，對八肋游仆蟲中正常翻譯終止位點及移碼位點中終止密碼子及四核苷酸序列的使用頻率進行了比較，結(jié)果顯示UAA和UAA-A在正常翻譯終止位點和移碼位點中都是優(yōu)先使用的，但移碼位點中UAA及UAA-A的使用頻率要顯著高于正常翻譯終止位點。這些結(jié)果說明在游仆蟲中，終止密碼子UAA及四核苷酸序列UAA-A可能更有利于移碼的發(fā)生。八肋游仆

10、蟲大核基因組中含有12種反密碼子環(huán)擴大的特殊tRNAs，對其核酸序列進行分析結(jié)果表明這些tRNAs含有保守的基因內(nèi)啟動子，TATA-box以及終止信號。隨后對八肋游仆蟲的small RNA進行了高通量測序，結(jié)果表明除Contig34792外，其他特殊tRNAs均具有轉(zhuǎn)錄活性。
　　5.基于核酸序列信息，共鑒定出23個包含讀框內(nèi)終止密碼子的基因。對其中編碼組織蛋白酶B的基因進行了序列分析及同源序列比對，結(jié)果顯示，在八肋游仆蟲中，UA

11、A和UAG既可作為終止密碼子，又可以編碼氨基酸;質(zhì)譜分析檢測到AMP結(jié)合酶家族蛋白的三條肽段，證明在八肋游仆蟲體內(nèi)，含有讀框內(nèi)終止密碼子的基因能夠翻譯出有功能的蛋白產(chǎn)物。
　　6.建立了八肋游仆蟲基因組數(shù)據(jù)庫(Euplotes octocarinatus Genome Database，EOGD，http://ciliates.ihb.ac.cn/database/species/eo)，該數(shù)據(jù)庫整合了本研究測得的八肋游仆蟲大核基