八肋游仆蟲中編程性核糖體移碼基因的鑒定及其分子機(jī)制研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的合成是所有生物體中的基本生命過程。核糖體維持正確的讀框?qū)τ诘鞍踪|(zhì)的合成至關(guān)重要，一旦發(fā)生移碼，將會(huì)導(dǎo)致截短的或無義蛋白的生成，從而造成翻譯能量的損耗，加重細(xì)胞清除及質(zhì)控機(jī)制的負(fù)擔(dān)。然而，在某些特殊情況下，翻譯中的核糖體能夠在mRNA的特定位置，從起始的0讀框轉(zhuǎn)換到-1或+1讀框，然后繼續(xù)進(jìn)行翻譯，這一過程被稱作編程性核糖體移碼（programmed ribosomal frameshifting，PRF）。PRF現(xiàn)象首次在病毒中

2、發(fā)現(xiàn)，隨后越來越多的證據(jù)表明該現(xiàn)象普遍存在于從細(xì)菌到真核生物等生命進(jìn)化的各個(gè)分支。前期基于單個(gè)基因的研究顯示游仆蟲中具有高頻率的+1PRF現(xiàn)象。本研究對(duì)八肋游仆蟲（Euplotes octocarinatus）的大核基因組及轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序分析，從基因組水平對(duì)這一特殊現(xiàn)象及其分子機(jī)制進(jìn)行了深入探討。此外，還通過質(zhì)譜分析對(duì)預(yù)測的PRF基因加以驗(yàn)證。所得結(jié)果如下:
　　1.利用Illumina測序平臺(tái)對(duì)八肋游仆蟲大核基因組進(jìn)行測序，共

3、得到約11Gb原始數(shù)據(jù);將低質(zhì)量reads過濾后，采用meta-assembly的拼接策略進(jìn)行基因組組裝，將組裝結(jié)果中來自于細(xì)菌基因組及線粒體基因組的污染DNA去除后，最終得到41，980條Contigs，其N50為2，947bp，其中包含雙端端粒的Contigs有29，413條;隨后采用三種方法對(duì)拼接結(jié)果的完整性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明拼接結(jié)果基本完整，八肋游仆蟲大核基因組能夠編碼細(xì)胞營養(yǎng)生長階段所需的全部基因;最后，利用AUGUSTUS軟

4、件對(duì)大核基因組中的non-PRF Contigs進(jìn)行基因的從頭預(yù)測，共預(yù)測出29，076個(gè)完整基因，其中90％的基因有RNA-Seq數(shù)據(jù)的支持。對(duì)每條微染色體所包含的基因個(gè)數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示約83％的微染色體僅編碼一個(gè)基因;與其他纖毛蟲一樣，八肋游仆蟲非編碼區(qū)的AT含量比編碼區(qū)高。
　　2.利用二代測序技術(shù)，對(duì)生長階段的八肋游仆蟲轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，共得到4.9Gb數(shù)據(jù)。采用兩種方法對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，比較后選擇Tophat&C

5、ufflinks的組裝結(jié)果進(jìn)行后續(xù)分析，該方法共拼接出32，353條轉(zhuǎn)錄本，平均長度為1,300bp;基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用相似性搜索的策略，最終共預(yù)測出4，690個(gè)移碼位點(diǎn)，分布于3,866個(gè)編程性核糖體移碼基因中，其中+1PRF基因3，700個(gè)，+2/-1PRF基因166個(gè)。隨后通過跟其他游仆蟲進(jìn)行同源序列比對(duì)，共鑒定出5個(gè)-1PRF基因;對(duì)移碼基因進(jìn)行了Pfam結(jié)構(gòu)域注釋，KEGG信號(hào)通路注釋及GO功能注釋，注釋結(jié)果顯示游仆蟲中PR

6、F基因功能多樣，分布于多個(gè)信號(hào)通路及生物過程;利用GO信息，對(duì)移碼基因進(jìn)行了功能富集分析，結(jié)果表明移碼基因顯著富集于多個(gè)生物過程，主要涉及到磷酸化、去磷酸化及依賴泛素的蛋白降解等過程。
　　3.對(duì)八肋游仆蟲的總蛋白進(jìn)行了大規(guī)模質(zhì)譜分析，最終得到2，853種蛋白的肽段信息，其中253種為PRF蛋白;移碼位點(diǎn)被肽段覆蓋的基因有7個(gè)，全部為+1PRF基因，其中CUFF.27536.1的兩個(gè)+1位移碼位點(diǎn)均有肽段覆蓋。根據(jù)移碼位點(diǎn)肽段的氨

7、基酸序列信息，確定了游仆蟲中+1PRF基因的移碼發(fā)生在滑動(dòng)序列中終止密碼子TAR(R=A or G)的T處;此外還有89個(gè)PRF基因的移碼位點(diǎn)上下游均有肽段覆蓋，包括82個(gè)+1PRF基因以及7個(gè)+2PRF基因，這些肽段為證明游仆蟲中的PRF現(xiàn)象提供了間接的蛋白證據(jù);根據(jù)肽段信息，結(jié)合多序列比對(duì)結(jié)果，我們推測八肋游仆蟲的+2位移碼過程中，核糖體跳過了滑動(dòng)序列中終止密碼子TAR的TA兩個(gè)核苷酸。
　　4.對(duì)所有PRF基因移碼位點(diǎn)上下游

8、30bp的序列進(jìn)行保守序列模體的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除滑動(dòng)序列外，無其他保守序列元件;對(duì)滑動(dòng)序列的分析結(jié)果顯示，約92％的移碼位點(diǎn)由AAA密碼子和緊隨其后的終止密碼子組成，其余8％由其他密碼子和終止密碼子構(gòu)成，移碼位點(diǎn)共包含47種有義密碼子;在+1PRF基因的滑動(dòng)序列中XXX（三個(gè)核苷酸相同）類型的密碼子最多(97％)，而在+2PRF基因的滑動(dòng)序列中XTA（X代表任意核苷酸）類型的密碼子最多(73％)，5個(gè)-1PRF基因中，有3個(gè)基因的滑動(dòng)序

9、列為AAG TAA，其余兩個(gè)分別為TCT TAA和TTT TAA，其滑動(dòng)序列下游未檢測到假結(jié)或莖環(huán)等刺激結(jié)構(gòu);此外，對(duì)八肋游仆蟲中正常翻譯終止位點(diǎn)及移碼位點(diǎn)中終止密碼子及四核苷酸序列的使用頻率進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示UAA和UAA-A在正常翻譯終止位點(diǎn)和移碼位點(diǎn)中都是優(yōu)先使用的，但移碼位點(diǎn)中UAA及UAA-A的使用頻率要顯著高于正常翻譯終止位點(diǎn)。這些結(jié)果說明在游仆蟲中，終止密碼子UAA及四核苷酸序列UAA-A可能更有利于移碼的發(fā)生。八肋游仆

10、蟲大核基因組中含有12種反密碼子環(huán)擴(kuò)大的特殊tRNAs，對(duì)其核酸序列進(jìn)行分析結(jié)果表明這些tRNAs含有保守的基因內(nèi)啟動(dòng)子，TATA-box以及終止信號(hào)。隨后對(duì)八肋游仆蟲的small RNA進(jìn)行了高通量測序，結(jié)果表明除Contig34792外，其他特殊tRNAs均具有轉(zhuǎn)錄活性。
　　5.基于核酸序列信息，共鑒定出23個(gè)包含讀框內(nèi)終止密碼子的基因。對(duì)其中編碼組織蛋白酶B的基因進(jìn)行了序列分析及同源序列比對(duì)，結(jié)果顯示，在八肋游仆蟲中，UA

11、A和UAG既可作為終止密碼子，又可以編碼氨基酸;質(zhì)譜分析檢測到AMP結(jié)合酶家族蛋白的三條肽段，證明在八肋游仆蟲體內(nèi)，含有讀框內(nèi)終止密碼子的基因能夠翻譯出有功能的蛋白產(chǎn)物。
　　6.建立了八肋游仆蟲基因組數(shù)據(jù)庫(Euplotes octocarinatus Genome Database，EOGD，http://ciliates.ihb.ac.cn/database/species/eo)，該數(shù)據(jù)庫整合了本研究測得的八肋游仆蟲大核基