八肋游仆蟲酸性核糖體蛋白P1的性質(zhì)研究.pdf

1、真核生物酸性核糖體磷酸化蛋白簡稱P蛋白，包括P0、P1和P2三類。它們共同組成一個五聚體的柄狀復(fù)合物位于核糖體60S大亞基上，并與26S/28S rRNA的一個保守結(jié)構(gòu)域共同形成 GTPase活性中心，參與蛋白質(zhì)的合成。這些蛋白的等電點通常位于酸性范圍(PI3-5)內(nèi)，且可以被一些蛋白激酶(如CK2、PK60S、RAP)磷酸化。柄狀復(fù)合物作為核糖體上的重要結(jié)構(gòu)，最重要的作用是與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成。
　　八肋游仆蟲(E

2、uplotes octocarinatus)是一種淡水單細(xì)胞原生動物，細(xì)胞核具有雙態(tài)性，包括一個大核和一個小核。除了核結(jié)構(gòu)的特殊性外，游仆蟲在基因表達(dá)調(diào)控方面也有特殊之處，可以將UAA和UAG作為終止密碼子，而將UGA編碼為半胱氨酸或硒代半胱氨酸。
　　為了探討單細(xì)胞真核生物核糖體柄狀復(fù)合物的組成形式及在蛋白質(zhì)合成中的作用，本研究以八肋游仆蟲(E. octocarinatus)為實驗材料，通過生物信息學(xué)方法，分析八肋游仆蟲基因組及

3、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，找到2個酸性核糖體蛋白P1基因，從DNA和cDNA中都擴(kuò)增到這2個P1基因，命名為EoP1A和EoP1B，將2個基因克隆后分別構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-P1A和pGEX-6P-1-P1B，在E. coli BL21(DE3)中表達(dá)并分別純化。利用 pull-down分析了EoP1A和EoP1B之間的相互作用。利用核磁共振(NMR)檢測EoP1A的體外磷酸化作用。獲得的主要結(jié)果如下：
　　1.八肋游仆蟲EoP1A和E

4、oP1B基因的克隆及分析
　　分別以八肋游仆蟲 cDNA和大核基因組為模板，經(jīng) PCR得到兩個基因的開放閱讀框(ORF)及基因全序列，序列分析顯示，EoP1A基因和 EoP1B基因全長分別為803 bp和641 bp，兩個基因均不含內(nèi)含子，開放閱讀框均為357 bp，兩個基因編碼區(qū)的核苷酸序列相似性為76％，氨基酸序列相似性為81%。多序列比對結(jié)果顯示EoP1A和EoP1B的N端存在可以形成α-helix的幾段比較保守的氨基酸序列

5、，但N端起始區(qū)比其他生物的相應(yīng)區(qū)域多出了8個氨基酸；C端不存在多數(shù)生物中所具有的保守的氨基酸序列，其 C端比其他生物多了5-7個氨基酸，最后3個氨基酸為DEY。
　　2. EoP1A和EoP1B蛋白的表達(dá)與純化
　　將 EoP1A和EoP1B基因分別與表達(dá)質(zhì)粒 pET28a和 pGEX-6P-1連接，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-EoP1A和pGEX-6P-1-EoP1B，在E. coli BL21中表達(dá)并分別純化，獲得

6、較高純度的 EoP1A和 EoP1B蛋白。獲得的重組蛋白均經(jīng)過 Western印跡檢測。
　　3. EoP1A和EoP1B的相互作用分析
　　利用pull-down方法，檢測了EoP1A和EoP1B的相互作用，結(jié)果表明八肋游仆蟲P1的兩個亞型在體外可以進(jìn)行相互作用。
　　4. EoP1A蛋白體外磷酸化作用的檢測
　　利用 NetPhos2.0軟件在線分析 EoP1A蛋白氨基酸序列，預(yù)測潛在的磷酸化位點；通過定點突

7、變，構(gòu)建突變體，體外表達(dá)并純化突變體蛋白；同時在體外表達(dá)并純化蛋白激酶 CK2(CK2α和CK2β)；通過核磁共振(NMR)檢測 EoP1A蛋白體外磷酸化作用，結(jié)果顯示EoP1A蛋白被CK2磷酸化的位點位于蛋白N端的Ser8。
　　5.八肋游仆蟲P蛋白之間的相互作用。
　　通過 pull-down分析了八肋游仆蟲 EoP1A、EoP1B與 EoP2之間的相互作用，初步結(jié)果表明EoP1A和EoP1B均不能與EoP2相互作用。<

8、br>　　綜上所述，八肋游仆蟲酸性核糖體磷酸化蛋白 P1基因有兩個亞型(EoP1A和EoP1B)。與其他生物的 P1蛋白相比，游仆蟲兩個 P1蛋白 N端均插入了8個氨基酸，且 C端不保守；通過 pull-down實驗證明 EoP1A和 EoP1B存在相互作用。核磁共振(NMR)結(jié)果顯示 EoP1A可以在體外被 CK2磷酸化，磷酸化位點位于 N端的Ser8位。Pull-down并未檢測到EoP1A、EoP1B與EoP2間的相互作用。這些結(jié)