八肋游仆蟲大核人工染色體的構(gòu)建及L11、eRF1a、eRF3的細(xì)胞定位.pdf

1、原生動(dòng)物（Protozoa）是一類完整的、可營(yíng)獨(dú)立生活的單細(xì)胞有機(jī)體;是最原始、最簡(jiǎn)單、最低等的單細(xì)胞真核生物。細(xì)胞內(nèi)有各種特化的細(xì)胞器，具有維持生命和延續(xù)后代所需的一切功能。原生動(dòng)物的密碼子使用特殊性、多核現(xiàn)象、大核中基因大小的染色體結(jié)構(gòu)等特征，使其成為分子細(xì)胞生物學(xué)研究的理想材料和模式生物。目前，纖毛蟲作為模式生物在細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等相關(guān)研究中逐漸深入。纖毛蟲綱（Ciliata）是原生動(dòng)物中種類最多、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的一個(gè)綱。纖毛蟲

2、具有兩種類型細(xì)胞核，即大核與小核。大核具有轉(zhuǎn)錄活性，與細(xì)胞的RNA合成有關(guān)，也稱營(yíng)養(yǎng)核(vegetative nucleus);小核無轉(zhuǎn)錄活性，與細(xì)胞的DNA合成有關(guān)，也稱生殖核(reproduction nucleus)。無性生殖行橫分裂，有性生殖為接合生殖(conjugation)。八肋游仆蟲(Euplotes octocarinatus)是纖毛蟲綱游仆科(Euplotidae)的一個(gè)具有代表性的種。細(xì)胞內(nèi)只含有一個(gè)大核，一個(gè)小核。

3、大核中染色體被稱為基因大小的染色體，其特殊的結(jié)構(gòu)是:兩端是端粒和上下游調(diào)控序列（非編碼區(qū)）、中間是基因的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)。鑒于其特殊的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)、特殊的進(jìn)化地位及密碼子使用特異性等特點(diǎn)，我們將其作為研究對(duì)象。
　　人工染色體(artificial chromosome)是采用分子克隆技術(shù)人工組建的具有染色體功能的DNA分子。DNA復(fù)制起點(diǎn)、著絲粒、端粒是確保染色體復(fù)制及穩(wěn)定遺傳的三種必備功

4、能元件。例如酵母人工染色體(YAC)和細(xì)菌的人工染色體(BAC)的成功構(gòu)建極大推動(dòng)了生物基因組學(xué)的研究。綠色熒光蛋白基因(Green Fluorescent Protein，GFP)是近年來被廣泛使用的新型報(bào)告基因，GFP可自發(fā)熒光，具有熒光檢測(cè)方便且穩(wěn)定、無毒害、通用性、分子量小易于構(gòu)建載體、可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察、易于得到突變體等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于目的基因表達(dá)與蛋白定位、及共定位的功能組學(xué)研究中。
　　首先，為研究八肋游仆蟲中與蛋白質(zhì)

5、合成相關(guān)基因的功能，本文成功構(gòu)建了八肋游仆蟲含綠色熒光蛋白基因的大核人工染色體(Macronuclear ArtificialChromosome of E.octocarinatus Harboring Codon-optimized EGFP Gene, EoMAC_G),建立了八肋游仆蟲活細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)與定位體系;進(jìn)一步在八肋游仆蟲中進(jìn)行了綠色熒光蛋白基因的表達(dá)，并通過RNA干擾（RNA interference，RNAi）的方法

6、成功干擾了密碼子優(yōu)化后的GFP基因(Enhanced Green Fluorescent Protein inEuplotes octocarinatus，EGFP-Eo)的表達(dá)，證實(shí)了纖毛蟲中RNA干擾的可行性。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將攜帶有EoMAC_G的pBTub-Tel載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入八肋游仆蟲大核，分析了EGFP-Eo基因在八肋游仆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)EGFP-Eo產(chǎn)生的熒光均勻分布于八肋游仆蟲細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞進(jìn)行有絲分

7、裂的情況下熒光可持續(xù)20 d以上。相比pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的游仆蟲，人工染色體中的EGFP-Eo基因表達(dá)的熒光亮度強(qiáng)、穩(wěn)定且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。Western blotting分析進(jìn)一步證實(shí)了外源EGFP-Eo基因在細(xì)胞中過量表達(dá)。通過細(xì)菌喂食法進(jìn)行纖毛蟲RNA干擾實(shí)驗(yàn)，抑制了外源EGFP-Eo基因在八肋游仆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。
　　利用構(gòu)建的人工染色體不僅便于外源基因在八肋游仆蟲細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，對(duì)目的蛋白質(zhì)進(jìn)行活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)定位分析;還可

8、通過RNAi的方法調(diào)控外源基因在纖毛蟲細(xì)胞中的表達(dá)，便于目的基因功能的進(jìn)一步分析。
　　其次，為檢測(cè)八肋游仆蟲人工染色體的功能，我們將八肋游仆蟲中心蛋白基因克隆進(jìn)入八肋游仆蟲大核人工染色體中，對(duì)其進(jìn)行了活細(xì)胞定位分析，進(jìn)一步探討了其功能;研究發(fā)現(xiàn)中心蛋白分布于發(fā)育過程中的八肋游仆蟲棘毛的基體，其可能參與了新生基體中微管的復(fù)制及組裝，進(jìn)而參與八肋游仆蟲棘毛的形成。為進(jìn)行兩種目的蛋白質(zhì)的細(xì)胞共定位研究，我們構(gòu)建了八肋游仆蟲含紅色熒光蛋

9、白基因(Red Fluorescent Protein，RFP)的大核人工染色體EoMAC_R:即將β2微管蛋白基因的上下游調(diào)控序列和端粒序列分別克隆至pDsRed1-N1質(zhì)粒中的多克隆位點(diǎn)和紅色熒光蛋白基因的上下兩端。將第一類肽鏈釋放因子基因（eRF1a）和L11基因分別克隆進(jìn)入EoMAC_G和EoMAC_R兩個(gè)大核人工染色體中，在八肋游仆蟲細(xì)胞中進(jìn)行eRF1a與L11的共定位分析。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)二者在細(xì)胞中大核附近的細(xì)胞質(zhì)

10、中分布，且有共定位位點(diǎn)，二者共同參與八肋游仆蟲細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與終止的重要過程。eRF1a和eRF3是八肋游仆蟲中參與蛋白質(zhì)合成終止的兩類兩類肽鏈釋放因子，對(duì)二者在高等真核生物中的功能和相互作用關(guān)系已多有研究，但仍無細(xì)胞定位方面的研究報(bào)道。通過對(duì)二者的細(xì)胞定位分析顯示，在八肋游仆蟲細(xì)胞大核的內(nèi)側(cè)有共定位位點(diǎn)，說明二者共同參與了細(xì)胞內(nèi)重要的生物學(xué)過程，即蛋白質(zhì)合成終止的新生肽鏈的釋放。鑒于eRF3的多功能性，進(jìn)一步的分子細(xì)胞生物學(xué)研究有