肺炎嗜衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的預(yù)測(cè)、篩選及免疫活性研究.pdf

1、目的：預(yù)測(cè)、篩選肺炎嗜衣原體（Chlamydophila pneumoniae，Cpn）III型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system，T3SS)效應(yīng)蛋白編碼基因，并研究其免疫活性，探討預(yù)測(cè)的T3SS效應(yīng)蛋白重組蛋白在臨床Cpn血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：①通過生物信息學(xué)分析結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，預(yù)測(cè)Cpn T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因；②以Cpn AR39菌株總RNA為模板，RT-PCR從轉(zhuǎn)錄水平分析Cpn

2、 T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因在感染細(xì)胞的表達(dá)情況，并篩選出在感染后72小時(shí)有表達(dá)的基因；③PCR擴(kuò)增預(yù)測(cè)Cpn T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因，將其亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-2中構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/目的片段，經(jīng)PCR、測(cè)序鑒定后將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌 E.coli BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。采用SDS-PAGE和Western blot分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物；對(duì)溫度、IPTG和時(shí)間等誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行系列的優(yōu)化后，獲得可溶性表

3、達(dá)蛋白并大量誘導(dǎo)表達(dá)。GST純化樹脂純化重組蛋白，用tris8.0將目的蛋白透析降低谷胱甘肽濃度，BCA法測(cè)定蛋白濃度；用重組蛋白包被微孔板，建立間接ELISA法檢測(cè)臨床Cpn患者血清，評(píng)價(jià)重組蛋白的抗原性；用重組蛋白經(jīng)皮下注入免疫BALB/c小鼠，檢測(cè)免疫小鼠血清中重組蛋白多克隆抗體的效價(jià)，分析重組蛋白的免疫原性，并以制備的多克隆抗體為一抗，應(yīng)用間接免疫熒光檢測(cè)預(yù)測(cè)蛋白在感染細(xì)胞的定位情況，以篩選 Cpn分泌性蛋白。
　　結(jié)果：

4、通過生物信息學(xué)分析結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，預(yù)測(cè)了14個(gè)Cpn T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因：Cpn0704，Cpn0710，Cpn1022，Cpn0810，Cpn0962，Cpn0960， Cpn0422，Cpn0425，Cpn0323，Cpn0322，Cpn0432，Cpn0431，Cpn0434，Cpn0661。RT-PCR分析篩選了11個(gè)在感染后72h有表達(dá)的基因: Cpn0704，Cpn0710，Cpn1022，Cpn0810，Cpn09

5、62，Cpn0960，Cpn0422，Cpn0425，Cpn0323，Cpn0322， Cpn0431；PCR擴(kuò)增得到其目的片段；構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng) PCR和測(cè)序鑒定證實(shí)插入片段為目的基因，測(cè)序結(jié)果與 Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE結(jié)果顯示，在IPTG誘導(dǎo)下，重組工程菌分別表達(dá)了相對(duì)分子量（Mr）與預(yù)測(cè)分子量相近的蛋白，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行系列的優(yōu)化后，獲得5個(gè)可溶性表達(dá)蛋白：Cpn1022，Cpn0960，Cpn081

6、0，Cpn0704，Cpn0425，經(jīng)GST純化樹脂純化后，純度在98％以上；以純化的重組蛋白為包被抗原建立間接ELISA法，檢測(cè)臨床Cpn患者血清，我們收集了20例確診為Cpn感染患者血清和10例正常人的血清進(jìn)行ELISA分析，結(jié)果顯示:Cpn0810能識(shí)別全部病人的血清，Cpn0425能識(shí)別17個(gè)病人的血清，Cpn0960與Cpn0704能與14個(gè)病人的血清發(fā)生反應(yīng)，Cpn1022只識(shí)別11個(gè)病人的血清，而正常人的血清未出現(xiàn)上述反應(yīng)

7、。利用純化的Cpn1022， Cpn0960，Cpn0810，Cpn0704，Cpn0425重組蛋白免疫新 BALB/c小鼠，間接ELISA法測(cè)定兔免疫血清特異性抗體，效價(jià)分別為 Cpn0810與 Cpn0425達(dá)1:64000，Cpn0960與Cpn0704達(dá)1:32000，Cpn1022達(dá)1:16000；5種重組蛋白刺激 BALB/c小鼠，皮膚出現(xiàn)發(fā)熱、紅腫，6~10d后逐漸消失，遲發(fā)型超敏反應(yīng)（delayed type hyper

8、sensitivity，DTH）陽性。
　　結(jié)論：
　　1. Cpn0704，Cpn0710，Cpn1022，Cpn0810，Cpn0962，Cpn0960，Cpn0422，Cpn0425， Cpn0323，Cpn0322，Cpn0431在Cpn感染細(xì)胞后72h有轉(zhuǎn)錄；
　　2.成功構(gòu)建 pGEX-6P-2/Cpn0704，Cpn0710，Cpn1022，Cpn0810，Cpn0962， Cpn0960，Cpn0422

9、，Cpn0425，Cpn0323，Cpn0322，Cpn0431等11個(gè)原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21后表達(dá)出相應(yīng)的重組蛋白；
　　3. Cpn1022，Cpn0960，Cpn0810，Cpn0704，Cpn0425重組蛋白具有良好的免疫原性，能刺激BALB/c小鼠產(chǎn)生高效價(jià)的特異性抗體；
　　4. Cpn1022，Cpn0960，Cpn0810，Cpn0704，Cpn0425重組蛋白具有較好的抗原性，能與C