預(yù)測的鸚鵡熱嗜衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的定位及相關(guān)性質(zhì)的初步研究.pdf

1、目的：鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci， Cps）是一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，多宿主性的人獸共患病病原體，臨床上仍缺乏有效的防治藥物。尋找Cps和宿主細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，以作為研制防治性藥物的靶點(diǎn)是目前衣原體研究的“熱點(diǎn)”課題?，F(xiàn)有資料表明Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type III secretion system，T3SS）效應(yīng)蛋白是Cps與宿主細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵。本研究對預(yù)測、篩選的Cps T3SS效應(yīng)蛋白的定位和

2、表達(dá)進(jìn)行了初步的分析，并進(jìn)一步對其體外誘導(dǎo)人單核細(xì)胞（THP-1）分泌IL-6、IL-1β、TNF-α前炎癥因子（CKs）的水平進(jìn)行了檢測。方法：將預(yù)測的Cps T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因，經(jīng)原核表達(dá)、純化后獲得融合蛋白，用融合蛋白免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體，并以多克隆抗體為一抗，采用間接免疫熒光技術(shù)檢測預(yù)測蛋白在感染細(xì)胞的定位情況。分別在Cps感染Hela細(xì)胞后8h，18h，24h，36h，48h提取蛋白，用制備的一抗通過Wes

3、tern Blot（WB）來觀察蛋白表達(dá)時(shí)相。將多粘菌素 B處理過的GST-CPSIT_0271蛋白體外刺激THP-1細(xì)胞，并于6h、12h、24h、36h、48h收集細(xì)胞，采用ELISA檢測IL-6、TNF-α和IL-1β水平。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建的10個(gè)預(yù)測 Cps T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒：CPSIT_0139， CPSIT_0271， CPSIT_0363， CPSIT_0499， CPSIT_070

4、0， CPSIT_0788， CPSIT_0803，CPSIT_0959，CPSIT_0965，CPSIT_0991，經(jīng)測序鑒定證實(shí)插入片段為目的基因，測序結(jié)果與Genbank上登錄序列經(jīng)BLAST比對完全一致；經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得6個(gè)可溶性表達(dá)蛋白，分別是：CPSIT_0139，CPSIT_0271， CPSIT_0363，CPSIT_0700，CPSIT_0788，CPSIT_0959；間接ELISA法測定免疫小鼠血清特異性抗體的效價(jià)：C

5、PSIT_0363與CPSIT_0959為1:64000， CPSIT_0700與CPSIT_0788為1:32000，CPSIT_0271與CPSIT_0139為1:16000；
　　2.間接免疫熒光法顯示預(yù)測蛋白的分布與Cps包涵體的分布位置大致相同；
　　3. WB結(jié)果顯示 CPSIT_0139， CPSIT_0271， CPSIT_0363， CPSIT_0700， CPSIT_0788，CPSIT_0959分別在感

6、染后24h，36h，18h，24h，36h，18h才出現(xiàn)明顯的蛋白表達(dá)；
　　4.一定濃度的GST-CPSIT_0271蛋白能顯著誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、TNF-α和IL-1β，當(dāng)GST-CPSIT_0271蛋白濃度為2μg/mL~5μg/mL時(shí)，CKs的水平與蛋白呈明顯的劑量依賴關(guān)系；用5μg/mL的GST-CPSIT_0271蛋白刺激THP-1細(xì)胞24h時(shí)，TNF-α和IL-1β量達(dá)到高峰，隨后它們的水平逐漸下降，48

7、h時(shí)IL-6量達(dá)到高峰。
　　結(jié)論：
　　1. CPSIT_0139， CPSIT_0271， CPSIT_0363， CPSIT_0700， CPSIT_0788， CPSIT_0959重組蛋白具有良好的免疫原性，能刺激小鼠產(chǎn)生較高效價(jià)的抗體；CPSIT_0139，CPSIT_0271，CPSIT_0363，CPSIT_0700，CPSIT_0788， CPSIT_095可能分布在包涵體內(nèi)或包涵體膜上；
　　2. C