沙眼衣原體Omp2重組蛋白的表達(dá)和免疫活性研究.pdf

1、目的:構(gòu)建含沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)血清型D型外膜蛋白2(outer membrane protein 2,Omp2)167~434位氨基酸編碼基因(omp2')的重組表達(dá)載體,在大腸桿菌中表達(dá)Omp2重組蛋白,純化表達(dá)產(chǎn)物,測定重組蛋白的免疫活性,為探索Omp2重組蛋白在Ct感染診斷中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).方法:Ct血清型D型感染McCoy細(xì)胞后提取Ct基因組DNA,高保真PCR擴(kuò)增Omp2蛋白16

2、7~434位氨基酸殘基的基因片段,將此片段克隆至pUCm-T載體,經(jīng)酶切和PCR鑒定后,目的片段亞克隆至原核表達(dá)載體pET28b(+)中,構(gòu)建pET28b(+)/omp2'重組體,然后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3),酶切、PCR和測序驗(yàn)證陽性克隆,挑取單個(gè)含重組質(zhì)粒pET28b(+)/omp2'的工程菌陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)和IPTG誘導(dǎo)表達(dá),利用SDS-PAGE、Western blot進(jìn)行分析和鑒定;親和層析法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化,B

3、CA法測定純化的重組蛋白的濃度.用純化的Omp2重組蛋白(rOmp2')免疫家兔,通過ELISA法檢測免疫血清特異性抗體效價(jià).以純化的rOmp2'作為包被抗原,檢測Ct感染者陽性血清及對(duì)照血清,對(duì)rOmp2'的免疫反應(yīng)性作出評(píng)價(jià).結(jié)論:(1)成功構(gòu)建了pET28b(+)/omp2'原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌中表達(dá)出一相對(duì)分子質(zhì)量約為35×10<'3>的重組融合蛋白;(2)rOmp2'具有良好的免疫原性,能有效地刺激家兔產(chǎn)生特異性抗體;(