預測的鸚鵡熱嗜衣原體T3SS效應蛋白的定位、免疫原性及表達特性初步研究.pdf

1、目的
　　預測鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci，Cps）III型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system，T3SS)效應蛋白編碼基因，研究預測蛋白在感染細胞中的定位、免疫原性及其在感染細胞中的表達時相，為進一步研究其結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎。
　　方法
　　用計算機輔助的生物信息學方法Effective T3、BPBAac tool，以及根據(jù)其他文獻資料，預測Cps T3SS效

2、應蛋白編碼基因。提取Cps6BC菌株DNA為模板，設計特異性引物，PCR擴增預測Cps T3SS效應蛋白編碼基因，酶切后連接到載體pGEX-6P-1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-1/目的片段，經(jīng)PCR、測序鑒定后將其轉(zhuǎn)化至表達宿主菌E.coli BL21中，IPTG誘導表達。Western blot分析和鑒定表達產(chǎn)物；對溫度、IPTG濃度和時間等誘導表達條件進行系列的優(yōu)化后，獲得可溶性表達蛋白并大量誘導表達。GST樹脂純化重組蛋白，BC

3、A法測定蛋白濃度；將重組蛋白經(jīng)皮下注入免疫BALB/c小鼠，ELISA法檢測免疫小鼠血清中重組蛋白多克隆抗體的效價，以評價這些蛋白的免疫原性；并以制備的多克隆抗體為一抗，應用間接免疫熒光檢測預測蛋白在感染細胞中的定位。在Cps感染后2、8、24、48h后，用Western blot檢測這些蛋白的表達情況。
　　結(jié)果
　　應用生物信息學軟件預測了5個可能的Cps T3SS效應蛋白編碼基因：CPSIT_0930、CPSIT_07

4、67、CPSIT_0749、CPSIT_0580、CPSIT_0420。PCR擴增得到其目的片段；構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng) PCR和測序證實插入片段為目的基因，測序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE結(jié)果顯示，在IPTG誘導下，對誘導表達條件進行系列的優(yōu)化后，分別表達了相對分子量（Mr）與預測分子量相近的可溶性蛋白。重組蛋白經(jīng)GST樹脂純化后，免疫雌性BALB/c小鼠，收集血清，抗CPSIT_0930、CPSIT_0767、

5、CPSIT_0749抗體效價為1:16000，抗CPSIT_0580、CPSIT_0420效價為1:8000。IFA進行細胞內(nèi)定位發(fā)現(xiàn)CPSIT_0930、CPSIT_0767、CPSIT_0749、CPSIT_0580、CPSIT_0420均定位于包涵體內(nèi)。除CPSIT_0767在Cps感染后48h才開始表達外，其余蛋白均在感染后2h開始表達，8h后表達停止。
　　結(jié)論
　　1. CPSIT_0930、CPSIT_0767