簡(jiǎn)介：目的通過體外不同條件培養(yǎng)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，觀察血管生成素（ANGIOPOIETIN，ANG）及其受體TIE2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VULARENDOTHELIALGROWTHFACT，VEGF）表達(dá)變化規(guī)律，探討ANGTIE2、VEGF對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。方法（1）體外培養(yǎng)小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（REVERSETRANIONPOLYMERASECHAINREACTION，RTPCR）方法觀察正常糖對(duì)照組（DGLUCOSE56MMOLL，NG）、高滲對(duì)照組（MANNITOL25MMOLLDGLUCOSE56MMOLL，DM）、高糖刺激組（DGLUCOSE30MMOLL，HG）不同時(shí)間點(diǎn)刺激小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞后，ANG1、ANG2、TIE2、VEGFMRNA表達(dá)的變化。（2）脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染針對(duì)ANG2基因的PCDNA31ANG2質(zhì)粒和ANG2SIRNA，24H后RTPCR法檢測(cè)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞ANG2MRNA表達(dá)變化情況。（3）四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT）法觀察高糖刺激和轉(zhuǎn)染PCDNA31ANG2質(zhì)粒24H后腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的增殖情況。（4）TRANSWELL小室法觀察高糖刺激腎小球內(nèi)皮細(xì)胞24H后細(xì)胞遷移率變化情況。結(jié)果1高糖刺激組ANG1MRNA在12H表達(dá)明顯抑制，24H、72H、96H表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，0H、48H較正常對(duì)照組表達(dá)無明顯變化。高糖刺激組ANG2MRNA僅在24H、72H、96H表達(dá)明顯上調(diào)，而在0H、12H、48H與正常對(duì)照組比較表達(dá)無明顯變化。高糖刺激組TIE2MRNA在24H、72H、96H較正常對(duì)照組表達(dá)明顯升高，在0H、12H、48H與正常對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（2）高糖刺激組VEGFMRNA在24H、72H、96H較正常對(duì)照組表達(dá)明顯升高，在0H、12H、48H與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（3）轉(zhuǎn)染PCDNA31ANG2質(zhì)粒和ANG2SIRNA24H后，PCDNA31ANG2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組較正常糖對(duì)照組ANG2MRNA明顯升高，ANG2SIRNA轉(zhuǎn)染組較高糖刺激組ANG2MRNA明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4PCDNA31ANG2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖較正常對(duì)照組明顯增快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（5）高糖刺激組與正常糖對(duì)照組比較，高糖刺激組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞遷移率明顯升高，與正常糖對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論（1）體外培養(yǎng)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)ANG1、TIE2、VEGF，高糖可誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞ANG2MRNA表達(dá)。高糖環(huán)境可引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞ANGTIE2、VEGFMRNA表達(dá)的改變，并呈時(shí)間依賴性。（2）ANG2可促進(jìn)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，高糖可促進(jìn)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。

簡(jiǎn)介：分類號(hào)密級(jí)國(guó)際十進(jìn)分類號(hào)（UDC）第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)位論文牙齦卟啉單胞菌對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)（題名和副題名）王曉燕（作者姓名）指導(dǎo)教師姓名王勤濤教授（主任醫(yī)師）指導(dǎo)教師單位第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙周黏膜病科申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)名稱口腔臨床醫(yī)學(xué)（口腔內(nèi)科學(xué)）論文提交日期200804答辯日期200805論文起止時(shí)間2007年03月至2008年05月學(xué)位授予單位第四軍醫(yī)大學(xué)牙齦卟啉單胞菌對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)研究生王曉燕學(xué)科專業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)（口腔內(nèi)科學(xué)）所在單位第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙周黏膜病科導(dǎo)師王勤濤教授（主任醫(yī)師）資助基金項(xiàng)目“資助基金項(xiàng)目“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃2007BAI18B02關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞牙齦卟啉單胞菌人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)2008年05月

簡(jiǎn)介：山東大學(xué)碩士學(xué)位論文體外擴(kuò)增臍血巨核細(xì)胞的生物學(xué)特性及其體內(nèi)功能的研究姓名王海蓮申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)兒科學(xué)指導(dǎo)教師鞠秀麗20080506山東大學(xué)碩士學(xué)位論文MKMNCMEGAKARYOCYTEMONONUCLEARCELLS巨核細(xì)胞單個(gè)核細(xì)胞NOD／SCIDNONOBESEDIABETICSEVERECOMBINEDIMMUNODEFICIENT非糖尿病PBSPCRPDGFPEPISCFTNFTPOTXSLOPHOSPHATEBUFFEEDSALINEPOLYMETASECHAINREACTION免疫缺陷磷酸鹽緩沖液多聚酶鏈反應(yīng)PLATELETDERIVEDGROWTHFACTOR血小板衍生生長(zhǎng)因子PHYCOERYTHRINPROPIDIUMIODIDESTEMCELLFACTORTURNORNECROSISFACTORTHROMBOPOIETINTHROMBOXANSYNASE藻紅蛋白碘化丙啶千細(xì)胞因子腫瘤壞死因子血小板生成素血栓素合成酶

簡(jiǎn)介：目的1擬建立穩(wěn)定的小鼠子宮蛻膜基質(zhì)細(xì)胞DSC培養(yǎng)方法，觀察DSC形態(tài)特征和生物學(xué)特性。2在體外建立穩(wěn)定的從小鼠骨髓來源的單核細(xì)胞誘導(dǎo)成熟樹突狀細(xì)胞DC的培養(yǎng)體系，觀察DC形態(tài)特征和生物學(xué)特性。3建立細(xì)胞共培養(yǎng)模型，初步探討小鼠蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對(duì)成熟DC增殖的影響，為進(jìn)一步研究DC在誘導(dǎo)母胎免疫耐受中的作用打下良好的基礎(chǔ)。方法1選用孕齡68D的C57BL6孕鼠蛻膜組織，采用胰蛋白酶、膠原酶、透明質(zhì)酸酶混合消化，進(jìn)行蛻膜基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；催乳素PRL免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定；RTPCR檢測(cè)DSC表達(dá)的細(xì)胞因子和趨化因子。2應(yīng)用粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子GMCSF和白細(xì)胞介素4IL4誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞，相差顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化；FACS檢測(cè)細(xì)胞表面分子；3HTDR摻入法檢測(cè)DC刺激同種異體或同體T細(xì)胞增殖能力；ELISA檢測(cè)其分泌的細(xì)胞因子。3采用小鼠子宮DSC和成熟DC共培養(yǎng)技術(shù)，建立細(xì)胞共培養(yǎng)模型，觀察DSC對(duì)DC增殖的影響。結(jié)果1小鼠子宮DSC在接種24H后大部分已貼壁，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞成纖維母細(xì)胞狀，57D后細(xì)胞融合成單層。每45D傳代1次，傳代的細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，而傳代培養(yǎng)極性漸不明顯。PRL免疫組化顯示體外培養(yǎng)傳代后95％陽性細(xì)胞為蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞大小形狀均一，染色特點(diǎn)為胞質(zhì)內(nèi)可見細(xì)小的棕色顆粒，且越近胞核染色越深。RTPCR檢測(cè)DSC表達(dá)GMCSF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF、白介素2IL2、白介素10IL10等細(xì)胞因子；表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白2MCP2、單核細(xì)胞趨化蛋白3MCP3、胸腺活化相關(guān)的趨化性因子TRAC等趨化因子。2用GMCSFIL4細(xì)胞因子聯(lián)合培養(yǎng)3D后，有細(xì)胞集落形成；培養(yǎng)第5D開始，一部分細(xì)胞從集落脫落，懸浮于培養(yǎng)基中，呈現(xiàn)樹枝狀不規(guī)則變化；脂多糖LPS誘導(dǎo)后，成簇的細(xì)胞散開，大量的細(xì)胞脫落，多數(shù)為圓形或不規(guī)則形，表面有豐富的伸長(zhǎng)毛刺的低密度大細(xì)胞。成熟DC高表達(dá)DC相對(duì)特異性標(biāo)志CD11C、共刺激分子CD80、CD86、MHCII分子IA和I類分子H2KB。DC具有強(qiáng)烈的激活T細(xì)胞增殖的能力；1000個(gè)DC，即可有效激發(fā)T細(xì)胞增殖。LPS刺激成熟8DDC與未經(jīng)LPS刺激5DDC，其刺激同種異體或同體T細(xì)胞增殖能力明顯增高，結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且在各組中隨著DCT比例增加，其刺激T細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)LPS刺激的成熟DC分泌細(xì)胞因子IL12P70、IL6、TNFA和IL1B的水平明顯升高，與未經(jīng)LPS刺激的PBS組結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3成熟DC能在DSC單層上繼續(xù)生長(zhǎng)，沒有隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而走向自然凋亡，第15D鏡下觀察形成細(xì)胞集落，發(fā)生了克隆性增殖。結(jié)論1建立的混合酶消化全組分蛻膜的方法，簡(jiǎn)化了DSC的提純程序，能獲得高純度的合乎實(shí)驗(yàn)要求的DSC，具有經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、方便、可靠的特點(diǎn)。2細(xì)胞因子組合GMCSFIL4LPS在體外具有誘導(dǎo)小鼠骨髓來源的單核細(xì)胞分化為成熟DC的作用，建立的體外誘導(dǎo)小鼠骨髓單核細(xì)胞的方法可以獲得形態(tài)、表型和功能都非常典型的成熟DC，方法簡(jiǎn)便。3小鼠子宮DSC組成的微環(huán)境能逆轉(zhuǎn)成熟DC的自然凋亡，使其重新獲得增殖的能力。

簡(jiǎn)介：目的NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，具有廣泛的生物學(xué)功能，位于機(jī)體抵抗腫瘤和病毒感染的第一道防線；不需要預(yù)先刺激即可識(shí)別并殺傷腫瘤和病毒感染的細(xì)胞，同時(shí)又能通過早期分泌多種細(xì)胞因子如IFΓ、GMCSF和TNFΒ和趨化因子來調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答，因此，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。NK細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子不僅參與調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫，而且參與調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)的功能，在血液系統(tǒng)疾病，尤其是異基因骨髓移植中，在抑制和預(yù)防GVHD，促進(jìn)GVT效應(yīng)和促進(jìn)血液和免疫系統(tǒng)重建方面起重要作用。同時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)亦引起了人們的重視。因此，盡管關(guān)于NK細(xì)胞的發(fā)育分化和識(shí)別功能的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于T細(xì)胞和B細(xì)胞，近年來，關(guān)于NK細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)的研究引起了人們極大的興趣，并有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，成為免疫學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。近期的研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞表面存在識(shí)別靶細(xì)胞表面分子的活化受體和抑制性受體，NK細(xì)胞的效應(yīng)功能取決于活化信號(hào)與抑制性信號(hào)的綜合。抑制性受體能特異性識(shí)別靶細(xì)胞表面的MHCⅠ類分子并保護(hù)正常細(xì)胞不被殺傷，人的NK細(xì)胞抑制性受體主要有殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體KILLERCELLIGLIKERECEPTS，KIR和凝集素樣受體CD94NKG2A，在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能方面起重要作用?；罨荏w識(shí)別經(jīng)典、非經(jīng)典的MHCⅠ類分子或MHCⅠ類相關(guān)分子，在NK活化的啟動(dòng)方面起關(guān)鍵作用，其中尤為引人注目的是NKG2D，NKG2D的配基為非經(jīng)典的MHC樣分子MICAMHCCLASSⅠCHAINRELATEDA、MICBMHCCLASSⅠCHAINRELATEDB及ULBPUL16BINDINGPROTEIN，這些分子在許多上皮及非上皮來源的腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞和受到“應(yīng)激性刺激”的細(xì)胞均有表達(dá)或上調(diào)。研究表明，NKG2D的單獨(dú)活化即足以刺激NK細(xì)胞的活化，并能克服抑制性受體的強(qiáng)勢(shì)信號(hào)，因此，在NK細(xì)胞活化過程中起著舉足輕重的作用。而NKG2D配體的表達(dá)水平，可能決定著NKG2D的活化與否。目前世界上有六株細(xì)胞系被確認(rèn)具有典型NK細(xì)胞標(biāo)志，它們是YT、NK92、NKL、HANK1、KHYG1和NKYS。這些細(xì)胞系的免疫表型為CD1CD2CD3CD4CD5CD7CD8。CD16CD56CD57，具有NK活性，有無ADCC效應(yīng)。在這些細(xì)胞系中，YT細(xì)胞，來自一急性淋巴母細(xì)胞淋巴瘤和和胸腺瘤患者，1985年建系，為IL2非依賴或低依賴細(xì)胞系，具有NK細(xì)胞的典型表面標(biāo)志，但由于長(zhǎng)期在實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，只能檢測(cè)到NKG2B和NKG2D的MRNA表達(dá)，而不能檢測(cè)到其蛋白的表達(dá)。YT細(xì)胞相對(duì)于NK92和NKL細(xì)胞而言，其殺傷活性相對(duì)較地低。該研究選用YT細(xì)胞作為NKG2B和NKG2D轉(zhuǎn)染細(xì)胞的受體，來探討NKG2B和NKG2D分子的作用機(jī)制。方法1NKG2B和NKG2D克隆載體的構(gòu)建。從NK細(xì)胞系NK92細(xì)胞中經(jīng)RTPCR技術(shù)獲得NKG2BCDNA和NKG2DCDNA，與PGEMTEASY連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，構(gòu)建NKG2B和NKG2D克隆載體，進(jìn)行DNA序列測(cè)定2NKG2B和NKG2D真核表達(dá)載體的構(gòu)建。應(yīng)用限制性內(nèi)切酶將NKG2B和NKG2D基因從克隆載體上切下來，連接到熒光真核表達(dá)載體PEGFPN1上，構(gòu)建PGEMTEASYNKG2B和PGEMTEASYNKG2D真核表達(dá)載體3真核表達(dá)載體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定。將篩選出的PEGFPN1NKG2B和PEGFPN1NKG2D質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選，克隆，RTPCR鑒定NKG2B和NKG2DMRNA的表達(dá)，熒光顯微鏡、WESTERNBLOT和免疫組化方法鑒定NKG2B和NKG2D蛋白的表達(dá)4真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞及對(duì)YT細(xì)胞生物學(xué)功能影響。將PEGFPN1NKG2B和PEGFPN1NKG2D質(zhì)粒通過脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染到Y(jié)T細(xì)胞中，MTT方法檢測(cè)YT細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后的增殖情況與對(duì)OMDA231、PG、HEP2和RAJI腫瘤細(xì)胞的殺傷情況，RTPCR技術(shù)檢測(cè)殺傷相關(guān)分子中，抗病毒分子IFNΓ、細(xì)胞增殖分子IL2、溶膜分子PERFIN和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分子家族TNF超家族TNFΑ、FASFASL、TRAIL、TWEAK的轉(zhuǎn)錄水平，并同時(shí)設(shè)置ΒACTIN為RTPCR系統(tǒng)的內(nèi)參照。結(jié)果一、NKG2B和NKG2D全長(zhǎng)CDNA的克隆提取新鮮培養(yǎng)的NK92細(xì)胞的總RNA，取5UG總RNA為模板，以O(shè)LIGODT為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后用NKG2B和NKG2D的特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定和與PGEMTEASY載體連接、酶切鑒定后測(cè)序，證實(shí)已獲得的CDNA為NKG2B和NKG2D的全長(zhǎng)CDNA，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。二、PEGFPN1NKG2B和PEGFPN1NKG2D重組表達(dá)載體的構(gòu)建用PSTⅠ和XHOⅠ從克隆載體PGEMTEASYNKG2B切下NKG2B片段，與經(jīng)相同雙酶切的PEGFPN1質(zhì)粒進(jìn)行粘端連接；同樣用ECⅠ和BAMHⅠ從克隆載體PGEMTEASYNKG2D切下NKG2D片段，與經(jīng)相同雙酶切的PEGFPN1質(zhì)粒進(jìn)行粘端連接。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌HB101，利用PCR篩選陽性克隆，提取純化PCR陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定陽性的克隆即為構(gòu)建好的PEGFPN1NKG2B和PEGFPN1NKG2D重組表達(dá)載體。三、NKG2B和NKG2D在CHO細(xì)胞中的表達(dá)應(yīng)用脂質(zhì)體法將構(gòu)建好的PEGFPN1NKG2B和PEGFPN1NKG2D重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，G418篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)后，挑選抗性克隆，RTPCR鑒定MRNA的表達(dá)，熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光發(fā)出、WESTERNBLOT和免疫組化方法鑒定蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示構(gòu)建的PEGFPN1NKG2B和PEGFPN1NKG2D質(zhì)粒能夠轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并且有NKG2B和NKG2D的蛋白表達(dá)。四、NKG2B和NKG2D真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞及對(duì)其生物學(xué)功能影響應(yīng)用脂質(zhì)體法將構(gòu)建好的PEGFPN1NKG2B和PEGFPN1NKG2D重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞，MTT方法測(cè)定轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞增殖效應(yīng)和對(duì)OMDA231、PG、HEP2和RAJI腫瘤細(xì)胞的殺傷情況，RTPCR技術(shù)檢測(cè)殺傷功能相關(guān)分子的變化。結(jié)果顯示YT細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后增殖效應(yīng)沒有變化；NKG2B轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞后對(duì)OMDA231、PG、HEP2細(xì)胞殺傷活性無變化，而對(duì)RAJI有增強(qiáng)作用，殺傷相關(guān)分子IFNΓ、FASL、TRAIL有明顯降低。NKG2D轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞后對(duì)OMDA231、PG、HEP2和RAJI細(xì)胞殺傷活性均有增強(qiáng)作用，殺傷相關(guān)分子IFNΓ、IL2、TNFΑ、PERFIN、TWEAK有明顯增強(qiáng)。結(jié)論1通過基因工程技術(shù)獲得了全長(zhǎng)的NKG2B和NKG2D基因片段，并且測(cè)序正確，成功構(gòu)建了PEGFPN1NKG2B和PEGFPN1NKG2D真核表達(dá)載體。2經(jīng)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，能夠在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光，RTPCR檢測(cè)出MRNA的表達(dá)，WESTERNBLOT和免疫組化方法鑒定蛋白的表達(dá)。3轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前后增殖效應(yīng)沒有變化；NKG2B轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞后對(duì)OMDA231、PG、HEP2細(xì)胞殺傷活性無變化，而殺傷相關(guān)分子IFNΓ、FASL、TRAIL有明顯降低。NKG2D轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞后對(duì)OMDA231、PG、HEP2和RAJI細(xì)胞殺傷活性均有增強(qiáng)作用，殺傷相關(guān)分子IFNΓ、IL2、TNFΑ、PEFFIN、TWEAK有明顯增強(qiáng)。4NKGB和NKG2D基因修飾YT細(xì)胞為使用NK細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞治療奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。研究表明，YT細(xì)胞一方面可以作為基礎(chǔ)研究的工具，用于研究NK細(xì)胞分化發(fā)育和對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷機(jī)理的探討，闡明NKG2受體對(duì)NK細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)機(jī)制，另一方面，通過基因修飾，可以有目的、有針對(duì)性地對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行修飾，使得NK細(xì)胞更適合臨床過繼免疫治療腫瘤的應(yīng)用。

簡(jiǎn)介：安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文安徽醫(yī)科大學(xué)ANHUIMEDICALUNIVERSITY碩士學(xué)位論文非小細(xì)胞肺癌患者DAPK基因甲基化研究與去甲基化對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響STUDIESOFNONSMALLCELLLUNGCANCERPATIENTSWITHDAPKGENEMETHYLATIONTHEEFFECTOFDEMETHYLATIONONTHEBIOLOGICALBEHAVIOFLUNGCARCINOMACELLS宋超指導(dǎo)教師指導(dǎo)教師薛紹禮薛紹禮教授教授學(xué)科學(xué)科專業(yè)專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究方向研究方向肺癌基因血清學(xué)指標(biāo)的研究肺癌基因血清學(xué)指標(biāo)的研究論文工作時(shí)間論文工作時(shí)間2011年3月至月至2013年3月2013年4月安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文目錄中文摘要1英文摘要3前言5第一部分摘要（中文）6摘要（英文）7引言8材料和方法8結(jié)果14討論16結(jié)論19參考文獻(xiàn)20第二部分摘要（中文）22摘要（英文）23引言25材料和方法25結(jié)果32討論39結(jié)論41參考文獻(xiàn)42

簡(jiǎn)介：成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究THEEXPERIMENTALSTADY砸璜嘶IGICALCH甜幻時(shí)碗BANDDIFLLACMIATIONINTOSTEMEELSILIV舢學(xué)科門類醫(yī)學(xué)學(xué)科、專業(yè)外科學(xué)骨外科研究方向年級(jí)研究生姓名導(dǎo)師姓名起止日期脊柱脊髓損傷與修復(fù)2006級(jí)胡資兵曾榮教授200710200809廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨外科2009年5月學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明9IIIIIIIIIIIJIIIIJIIIIIIIIIIII10Y2013073本人呈交的學(xué)位論文系在導(dǎo)師指導(dǎo)下所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含為獲得廣東醫(yī)學(xué)院或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書所使用過的材料。作者簽名彈三壘蘭日期蘭墨壘學(xué)位論文知識(shí)產(chǎn)權(quán)聲明本人在就讀研究生期間所完成的學(xué)位論文及其相關(guān)成果，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬學(xué)校。本人在畢業(yè)離校前會(huì)將有關(guān)的研究資料和結(jié)果全部上交導(dǎo)師，離校后發(fā)表或使用學(xué)位論文或與該論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，署名單位仍然為廣東醫(yī)學(xué)院。學(xué)?？梢詫W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，可以公布包括刊登論文的全部或部分內(nèi)容。導(dǎo)師享有發(fā)表學(xué)位論文、申請(qǐng)成果和專利的權(quán)利。注保密的學(xué)位論文在解密后適用本聲明。作者簽名導(dǎo)師簽名硼竣乎諺學(xué)日期日期竺竺蘭蘭

簡(jiǎn)介：中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院碩士學(xué)位論文源于健康人與肝癌患者CIK細(xì)胞的生物學(xué)特性及抗癌活性的對(duì)比研究姓名劉巖青申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)肝膽外科指導(dǎo)教師董家鴻王悅?cè)A20080529軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文殖活性；在流式細(xì)胞儀上做動(dòng)態(tài)培養(yǎng)物的表型分析；并用MTT法檢測(cè)兩種來源CIK細(xì)胞殺傷SMMC一7721肝癌細(xì)胞的活性。結(jié)果1．兩種來源CIK細(xì)胞的增殖性能無明顯區(qū)別，PO．05。CIK細(xì)胞具有培養(yǎng)方法簡(jiǎn)易、擴(kuò)增迅速，兩種來源CIK細(xì)胞前后擴(kuò)增分別達(dá)到152．667107、143．500X107。2．以SMMC7721肝癌為靶細(xì)胞，在1．25I10L的效靶比范圍內(nèi)，兩種來源的CIK細(xì)胞的殺傷活性均無明顯差異。但對(duì)SMMC一7721肝癌細(xì)胞殺傷明顯。兩種來源CIK細(xì)胞在效靶比為101時(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷率最高，分別為0．262、0．260。3．兩種來源CIK細(xì)胞表面分子CD3CD56、CD45RA的變化無明顯差異，源于肝癌患者CIK細(xì)胞的CD8的陽性率與源于健康人CIK細(xì)胞的CD8的陽性率有明顯差異，前者高于后者；但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種來源CIK細(xì)胞中CD3CD56雙陽性細(xì)胞和CD8細(xì)胞的百分含量逐漸升高，而CD45RA細(xì)胞的百分含量逐漸減少。結(jié)論源于健康人CIK細(xì)胞與源于肝癌患者CIK細(xì)胞的生物學(xué)特性、增值活性及細(xì)胞毒活性均無明顯差異；源于肝癌患者CIK細(xì)胞的CD8陽性率高于健康人來源的CIK細(xì)胞CD8陽性率，CD3CD56、CD45RA的陽性率無明顯差異。CIK細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)易、擴(kuò)增迅速。對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC一7721殺傷率高。具有良好的臨床應(yīng)用前景。第二部分CIK細(xì)胞聯(lián)合化療的抗腫瘤研究目的觀察CIK細(xì)胞表型、體外增殖活性和細(xì)胞毒活性變化，并探討CIK細(xì)胞對(duì)化療的輔助治療作用。方法提取健康供血者的PBMC，常規(guī)誘導(dǎo)出CIK細(xì)胞，動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng)物增殖活性和表型變化；并用MTT法測(cè)定其體外細(xì)胞毒活性；在BALB／C裸鼠皮下接SMMC7721肝癌細(xì)胞，化療后應(yīng)CIK細(xì)胞進(jìn)行免疫治療，分成對(duì)照組、4

簡(jiǎn)介：中山大學(xué)碩士學(xué)位論文低分子肝素及肝素結(jié)合型表皮生長(zhǎng)因子對(duì)人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響姓名吳曉霞申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師張建平20070520◇之童碩士論文中文摘要2、探討LMWH是否可以對(duì)體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生作用，影響其增殖、侵襲及分化能力。3、LML|『H、HBEGF單獨(dú)或共同作用于滋養(yǎng)細(xì)胞，觀察Ⅲ州和HBFM；F是否存在對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞影響的相互作用。研究方法1滋養(yǎng)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定人早孕期絨毛組織取自復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院5～10孕周行人工流產(chǎn)的正常妊娠婦女。按照胰蛋白酶／DNA酶I消化和密度梯度離心兩步法分離滋養(yǎng)細(xì)胞。分離后的細(xì)胞用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定細(xì)胞及其純度。20％胎牛血清的叫跚高糖培養(yǎng)液體外培養(yǎng)。2姍H對(duì)人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響21實(shí)驗(yàn)分組LMWH組成分為ENOXAPARIN，藥物終濃度為0025IU／M1、025IU／M1、25IU／ML、25IU／M1、250IU／M1，對(duì)照組即蹦蹦培養(yǎng)液組。22枷嚇增殖試驗(yàn)研究不同濃度LMWH對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖能力的影響作用。將人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞加入預(yù)先包被MATRIGEL的96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜。在培養(yǎng)液中添加各種處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)48H。行W丌比色試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。23TRANSWELL侵襲試驗(yàn)研究不同濃度LMWH對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的影響作用。預(yù)先將TRANSWELL板包被MATRIGEL備用。往上室加入滋養(yǎng)細(xì)胞懸液，并分別加入各種處理因素；下室加入叫聊高糖培養(yǎng)液，37℃，5％C0培養(yǎng)箱中孵育48H。棉簽輕輕拭去上室濾膜內(nèi)面的細(xì)胞，保留定向遷移至濾膜下表面的細(xì)胞，多聚甲醛固定，蘇木素染色，中性樹膠封片，高倍顯微鏡200倍下每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞。24HCG分泌試驗(yàn)研究不同濃度LMWH對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞分化能力的影響作用。將滋養(yǎng)細(xì)胞加入24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜。在培養(yǎng)液中添加各種處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)48H。收集各孔的培養(yǎng)上清液，儲(chǔ)存于一20℃?zhèn)溆?，采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定BHOG濃度。

簡(jiǎn)介：華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文LRIG2對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系GL15生物學(xué)特性的影響及其分子生物學(xué)機(jī)制研究姓名王寶峰申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)外科學(xué)（神經(jīng)外科）指導(dǎo)教師雷霆20090501華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文3第二部分第二部分LRIG2基因短發(fā)夾基因短發(fā)夾RNA表達(dá)穩(wěn)定株的建立及下調(diào)表達(dá)穩(wěn)定株的建立及下調(diào)LRIG2對(duì)EGFR信號(hào)通路的影響信號(hào)通路的影響目的目的構(gòu)建針對(duì)LRIG2基因的短發(fā)夾RNASHRNA的表達(dá)載體，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株觀察目的基因表達(dá)的變化及其對(duì)EGFR信號(hào)通路的影響。方法方法根據(jù)GENBANK中LRIG2基因序列設(shè)計(jì)2條RNA干擾序列，命名LRIG2SHRNA1、LRIG2SHRNA2，同時(shí)設(shè)計(jì)1條非特異性序列作為陰性對(duì)照。據(jù)此設(shè)計(jì)合成各自的寡核苷酸鏈，退火后連接入PGENESIL2載體，轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后進(jìn)行序列測(cè)定。用不同濃度的G418作用于GL15細(xì)胞，得到G418對(duì)于GL15細(xì)胞的篩選濃度。3種重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL15細(xì)胞，用G418篩選后挑單克隆后擴(kuò)增獲得穩(wěn)定株。逆轉(zhuǎn)錄RTPCR和WESTERN印跡法分別在MRNA和蛋白水平上檢測(cè)LRIG2的表達(dá)。用表皮生長(zhǎng)因子EGF100NGML體外干預(yù)得到的穩(wěn)定細(xì)胞株，WESTERNBLOT測(cè)定EGFR和磷酸化EGFR水平的變化。結(jié)果結(jié)果3種重組表達(dá)載體PGENESIL2LRIG2SHRNA1、PGENESIL2LRIG2SHRNA2和PGENESIL2NEGATIVESHRNA經(jīng)限制性酶切及DNA測(cè)序分析證明序列插入正確。G418對(duì)于GL15細(xì)胞的篩選濃度為600GML，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒的GL15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染PGENESIL2LRIG2SHRNA2組細(xì)胞LRIG2MRNA和蛋白表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染PGENESIL2NEGATIVESHRNA組PGENESIL2LRIG2SHRNA1組LRIG2蛋白無明顯變化。EGF刺激5分鐘和30分鐘后，PGENESIL2LRIG2SHRNA2組細(xì)胞EGFR和PEGFR蛋白水平均低于對(duì)照組。結(jié)論結(jié)論成功構(gòu)建了針對(duì)LRIG2基因的SHRNA表達(dá)載體PGENESIL2LRIG2SHRNA2，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可抑制LRIG2基因表達(dá)，LRIG2與LRIG1作用相反，下調(diào)LRIG2可減少EGF誘導(dǎo)的EGFR磷酸化，促進(jìn)EGFR降解。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞富含亮氨酸重復(fù)序列免疫球蛋白樣蛋白2；RNA干擾；短發(fā)夾RNA；EGFR

簡(jiǎn)介：南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文大鼠頜骨與髂骨來源骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外生物學(xué)特性的比較研究姓名許艷彬申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師陶震江20080510南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文壘太鼠題置量壁量塞遮置煎基廈王細(xì)胞佳之I生物堂掛眭的出筮巫究竺是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。論文中除了特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對(duì)本研究的啟發(fā)和所做的貢獻(xiàn)均在論文中作了明確的聲明并表示了謝意。專業(yè)一作者簽名料日期出己論文使用授權(quán)聲明本人完全了解南京醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存論文。保密的論文在解密后遵守此規(guī)定。作者簽名導(dǎo)師虢繼日期壟疊蘭受‘

簡(jiǎn)介：蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文PPARΓ和CTGF對(duì)人胃癌BGC823細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制的研究姓名張芳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師李敏王金穗20080501蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文510MG／LCTGFMAB處理組BGC823細(xì)胞其侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)為79941608，遷移穿膜細(xì)胞數(shù)為6674士512，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義尸O05。6PRAR，L蛋白在BGC823細(xì)胞中有表達(dá)，RSG處理組PRARL染色陽性強(qiáng)度強(qiáng)于對(duì)照組PRART染色氏O05。7CTGF蛋白在BGC823細(xì)胞中有表達(dá)，RSG處理組、CTGFMAB處理組CTGF染色陽性強(qiáng)度均弱于對(duì)照組CTGF染色尸O01。8COX2。蛋白在BGC823細(xì)胞中有表達(dá)，RSG處理組、CTGFMAB處理組COX02染色陽性強(qiáng)度均弱于對(duì)照組COX2染色氏O01。9LVILVLP2蛋白在BGC823細(xì)胞中有表達(dá)，RSG處理組、CTGFMAB處理組MMP2染色陽性強(qiáng)度均弱于對(duì)照組MMP2染色尸O01。10501TMOL／LRSG處理組BGC823細(xì)胞，其CTGFMRNA、COX2MRNA和MMP2MRNA相對(duì)光密度值均顯著低于對(duì)照組相對(duì)光密度值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義尸‘005或P001。1110MG／LCTGFMAB處理組BGC823細(xì)胞，其COX2MRNA和MMP2MRNA相對(duì)光密度值均顯著低于對(duì)照組相對(duì)光密度值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義PO01。結(jié)論1PPAR7激動(dòng)劑RSG能抑制BGC823細(xì)胞增殖，并且在一定范圍內(nèi)呈劑量時(shí)間依賴性。RSG可明顯抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。提示RSG的作用可能與激活PPAR7介導(dǎo)的信號(hào)途徑有關(guān)I2CTGFMAB能夠抑制BGC823細(xì)胞增殖，同時(shí)能夠降低BGC823細(xì)胞的侵襲和遷移能力。提示CTGF可能促進(jìn)BGC823細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。3RSG、CTGFMAB均能誘導(dǎo)BGC一823細(xì)胞形態(tài)的改變。4RSG、CTGFMAB分別下調(diào)BGC823細(xì)胞COX2和MMP2表達(dá)，提示RSG、CTGFMAB對(duì)于BGC823細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，可能是通過負(fù)性調(diào)控COX2和MMP2而實(shí)現(xiàn)的。5RSG下調(diào)BGC823細(xì)胞CTGF表達(dá)，提示活化的PPARY對(duì)BGC一823細(xì)胞的抑制作用可能是通過部分下調(diào)CTGF的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。關(guān)鍵詞人胃癌細(xì)胞系BGC823；過氧化物酶體增生物激活受體丫；羅格列酮；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子Ⅱ

簡(jiǎn)介：溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文冬凌草甲素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PATU8988生物學(xué)特性影響及機(jī)制的研究姓名朱延安申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)普通外科學(xué)指導(dǎo)教師董米連20081101溫州醫(yī)學(xué)院硬士學(xué)位論文BD2、STAT3、VEGF、MMP9的表達(dá)變化。三、結(jié)果MYR結(jié)果顯示隨著冬凌草甲素藥物濃度的增加2，4。8，16，32，64，128MG／L和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，PATU8988細(xì)胞的增殖明顯受到抑制。光學(xué)顯微鏡觀察，隨著冬凌草甲素藥物濃度的增加出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征改變表現(xiàn)為胞漿空泡，核染色質(zhì)向核一側(cè)固縮呈現(xiàn)半月形，并可見凋亡小體，細(xì)胞體積縮小。在2MG／L作用24H基本無凋亡，8MG／L作用24H可見部分凋亡，至72H內(nèi)，凋亡現(xiàn)象明顯。128MG／L作用8H即開始呈現(xiàn)凋亡，作用2411開始出現(xiàn)壞死。流式細(xì)胞儀分析測(cè)定ANNEXIN、PI。細(xì)胞率，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素O，8，16，32，64RAG／L作用24小時(shí)后，PATU8988細(xì)胞凋亡比率隨冬凌草甲素誘導(dǎo)濃度升高而增加。FACS測(cè)定PATU8988細(xì)胞線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位降低PO．05。冬凌草甲素4，8，16，32，64RAG／L誘導(dǎo)PATU8988細(xì)胞24H后，半定量分析刪8988細(xì)胞P53、1K12、S尉函3、VEGF、MMP9MRNA表達(dá)水平。未處理的PA弧，8988細(xì)胞均有BD．2、S“M3、VEGF、MMP9的MRNA表達(dá)，加入冬凌草甲素后，1K12、STAT3、VEGF、MMP9的表達(dá)隨藥物濃度增加表達(dá)下降，而P53的MRNA表達(dá)水平，隨藥物濃度增加而上升，也呈劑量依賴。四、結(jié)論1．冬凌草甲素能抑制P棚78988細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有一定的濃度和時(shí)間依賴性。2．能誘導(dǎo)PATE8988細(xì)胞凋亡，經(jīng)冬凌草甲素處理后PATU8988細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞典型的形態(tài)學(xué)特征改變，流式細(xì)胞儀分析測(cè)定ANNEXINV陽性細(xì)胞率，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素作用24小時(shí)后，PATU8988細(xì)胞凋亡比率隨藥物濃度升高而增加。線粒體膜電位降低也說明細(xì)胞的凋亡。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其主要細(xì)胞毒作用之一。3．能抑制VEGF、MMP．9的MRNA表達(dá)，從而可能降低PATU8988細(xì)胞的侵襲性。抑制STAT3的表達(dá)，抑制增殖作用可能與此有關(guān)。4．在細(xì)胞凋亡過程中抑癌基因P53基因上調(diào)，而抗凋亡基因BCL．2基因下調(diào)，可能是其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。關(guān)鍵詞人胰腺癌細(xì)胞凋亡冬凌草甲素P53IKL2STAT3VEGFM【MP．93

簡(jiǎn)介：目的研究人MIRNA10B（HASMICRNA10B，微小RNA10B）在胰腺癌細(xì)胞系PANC1中的表達(dá)情況及其對(duì)胰腺癌細(xì)胞系PANC1生物學(xué)功能的影響。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MIRNA10B在胰腺癌細(xì)胞系PANC1中的表達(dá)情況。通過化學(xué)合成成熟型人MIRNA10B模擬體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至PANC1細(xì)胞中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)進(jìn)行鑒定，檢測(cè)MIRNA10B的表達(dá)量。采用MTT法檢測(cè)MIRNA10B對(duì)PANC1細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)PANC1細(xì)胞凋亡的影響，TRANSWELL小室檢測(cè)對(duì)PANC1細(xì)胞的侵襲功能的影響，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)PANC1細(xì)胞遷移功能的影響，以探討表達(dá)上調(diào)的MIRNA10B對(duì)胰腺癌細(xì)胞系PANC1所起的生物學(xué)作用。結(jié)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示MIRNA10B在PANC1中相對(duì)表達(dá)量為（3606±0423），（P005）。MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24H、48H、72H和96H時(shí)間點(diǎn)三組細(xì)胞的增值活性無明顯差別（P005）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MIRNA10B轉(zhuǎn)染組凋亡率為（1231±310），陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為（1376±313）、（1628±419），（P005）。TRANSWELL小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MIRNA10B轉(zhuǎn)染組PANC1細(xì)胞穿膜數(shù)為（713±53）個(gè)，陰性對(duì)照組（301±34）個(gè)，空白對(duì)照組（292±52）個(gè)，MIRNA10B轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組（P結(jié)論MIRNA10B在胰腺癌細(xì)胞系PANC1中明顯高表達(dá)?；瘜W(xué)合成的成熟型MIRNA10B可以轉(zhuǎn)染入PANC1細(xì)胞，能顯著提高轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MIRNA10B的表達(dá)量，并有效發(fā)揮上調(diào)作用。轉(zhuǎn)染MIRNA10B后對(duì)PANC1細(xì)胞的體外侵襲和遷移能力有顯著的促進(jìn)作用，但對(duì)PANC1細(xì)胞的增殖和早期凋亡無明顯影響。

簡(jiǎn)介：前言FABRCA通路是正常細(xì)胞參與DNA修復(fù)、細(xì)胞周期與凋亡調(diào)控、解毒功能調(diào)節(jié)、生命信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等必需的。如果該通路受損會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞染色體不穩(wěn)定以及對(duì)DNA損傷劑高度敏感。FA復(fù)合體的穩(wěn)定和FANCD2的泛素化激活是FABRCA通路的關(guān)鍵步驟，而FANCF在此過程中發(fā)揮著重要作用。FANCF蛋白低表達(dá)或功能缺失會(huì)干擾FABRCA通路的正常功能，進(jìn)而參與腫瘤發(fā)生及耐藥性的形成。目前，已在多種實(shí)體腫瘤中證實(shí)FANCF蛋白低表達(dá)或功能缺失，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性的形成相關(guān)。而關(guān)于FANCF是否參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及耐藥性的產(chǎn)生與調(diào)控尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究FANCF基因沉默對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，并檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)的變化，探討FANCF基因是否參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性的形成。實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)分為三部分1、FANCFSHRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，使用AMBION公司的在線設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)并合成能夠編碼針對(duì)FANCF基因的小發(fā)夾RNAFANCFSHRNA的DNA模板，將其插入到PSLIENCERTM41CMVNEO表達(dá)質(zhì)粒中，形成PSLIENCERTM41CMVFANCFSHRNA重組質(zhì)粒；將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到ECOLI感受態(tài)細(xì)胞JM109中，通過氨芐青霉素抗藥性篩選出成功轉(zhuǎn)化的陽性克隆，并進(jìn)行擴(kuò)增；通過PCR及基因測(cè)序方法篩選出插入正確的FANCFSHRNA表達(dá)質(zhì)粒；2、MCF7FANCFRNAI細(xì)胞模型的建立堿裂解法提取質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF7細(xì)胞，RTPCR法檢測(cè)FANCF基因MRNA表達(dá)水平，確認(rèn)FANCF基因沉默；3、相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)分別采用MTT法、流式細(xì)胞儀PI單染法及FITCPI雙染法檢測(cè)FANCF基因沉默前后細(xì)胞增殖、周期及凋亡等生物學(xué)特性的變化；RTPCR法檢測(cè)FANCF基因沉默前后耐藥相關(guān)基因BCRP、PGP、MRP、LRPMRNA表達(dá)水平的變化。離體水平探討FANCF與乳腺癌生物學(xué)特性及耐藥性形成的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、成功構(gòu)建FANCFSHRNA表達(dá)質(zhì)粒含有重組質(zhì)粒的陽性克隆菌液PCR擴(kuò)增片段約為250BP，并且其基因測(cè)序結(jié)果顯示插入片段堿基排列順序正確，沒有突變，說明FANCFSHRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功；2、成功建立MCF7FANCFRNAI細(xì)胞模型與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染FANCFSHRNA質(zhì)粒后第2天、第3天、第5天和第7天，F(xiàn)ANCF基因MRNA表達(dá)水平均明顯減低，表達(dá)抑制率分別為3651％±684％、3703％±661％、5303％±933％和3951％±1013％，說明FANCF基因沉默，MCF7FANCFRNAI細(xì)胞模型成功建立；3、FANCF基因沉默對(duì)人乳腺癌MCF7細(xì)胞生物學(xué)特性的影響與陰性對(duì)照組相比，F(xiàn)ANCF基因沉默可抑制MCF7細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染后48H和72H的抑制率分別為1265％±124％和2964％±087％，促進(jìn)細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染后48H和72H的凋亡率分別為2895％±181％和4900％±232％，并使細(xì)胞周期阻滯于S期轉(zhuǎn)染后48H，S期細(xì)胞比率為3338％±068％；4、FANCF基因沉默對(duì)人乳腺癌MCF7細(xì)胞耐藥性的影響與陰性對(duì)照組相比，F(xiàn)ANCF基因沉默后，BCRPMRNA表達(dá)水平明顯降低，轉(zhuǎn)染后第3天、第5天和第7天的表達(dá)抑制率分別為3514％±871％、3839％±838％和2723％±698％；PGPMRNA表達(dá)水平略有降低，轉(zhuǎn)染后第7天表達(dá)抑制率為2998％±342％；MRP和LRPMRNA表達(dá)無明顯變化。結(jié)論1、FANCF基因沉默可抑制人乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞周期阻滯于S期；2、FANCF基因沉默可抑制BCRP等耐藥相關(guān)基因的MRNA表達(dá)，參與乳腺癌細(xì)胞耐藥性的調(diào)控。