小鼠子宮蛻膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性及其對(duì)樹突狀細(xì)胞增殖影響的研究.pdf

1、目的： 1.擬建立穩(wěn)定的小鼠子宮蛻膜基質(zhì)細(xì)胞(DSC)培養(yǎng)方法，觀察DSC形態(tài)特征和生物學(xué)特性。 2.在體外建立穩(wěn)定的從小鼠骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞誘導(dǎo)成熟樹突狀細(xì)胞(DC)的培養(yǎng)體系，觀察DC形態(tài)特征和生物學(xué)特性。 3.建立細(xì)胞共培養(yǎng)模型，初步探討小鼠蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對(duì)成熟DC增殖的影響，為進(jìn)一步研究DC在誘導(dǎo)母胎免疫耐受中的作用打下良好的基礎(chǔ)。 方法： 1.選用孕齡6-8d的C57BL/6孕鼠蛻膜組織，

2、采用胰蛋白酶、膠原酶、透明質(zhì)酸酶混合消化，進(jìn)行蛻膜基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；催乳素(PRL)免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定；RT-PCR檢測(cè)DSC表達(dá)的細(xì)胞因子和趨化因子。 2.應(yīng)用粒細(xì)胞.巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞，相差顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化；FACS檢測(cè)細(xì)胞表面分子；3H-TdR摻入法檢測(cè)DC刺激同種異體或同體T細(xì)胞增殖能力；ELISA檢測(cè)其分泌的細(xì)

3、胞因子。 3.采用小鼠子宮DSC和成熟DC共培養(yǎng)技術(shù)，建立細(xì)胞共培養(yǎng)模型，觀察DSC對(duì)DC增殖的影響。 結(jié)果： 1.小鼠子宮DSC在接種24h后大部分已貼壁，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞成纖維母細(xì)胞狀，5-7d后細(xì)胞融合成單層。每4-5d傳代1次，傳代的細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，而傳代培養(yǎng)極性漸不明顯。PRL免疫組化顯示體外培養(yǎng)傳代后95％陽(yáng)性細(xì)胞為蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞大小形狀均一，染色特點(diǎn)為胞質(zhì)內(nèi)可見細(xì)小的棕色顆粒，且越近胞核染色越

4、深。RT-PCR檢測(cè)DSC表達(dá)GM-CSF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白介素-2(IL-2)、白介素-10(IL-10)等細(xì)胞因子；表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白-2(MCP-2)、單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3)、胸腺活化相關(guān)的趨化性因子(TRAC)等趨化因子。 2.用GM-CSF+IL-4細(xì)胞因子聯(lián)合培養(yǎng)3d后，有細(xì)胞集落形成；培養(yǎng)第5d開始，一部分細(xì)胞從集落脫落，懸浮于培養(yǎng)基中，呈現(xiàn)樹枝狀不規(guī)則變化；脂多糖(LPS)誘導(dǎo)后，成

5、簇的細(xì)胞散開，大量的細(xì)胞脫落，多數(shù)為圓形或不規(guī)則形，表面有豐富的伸長(zhǎng)毛刺的低密度大細(xì)胞。成熟DC高表達(dá)DC相對(duì)特異性標(biāo)志CD11c、共刺激分子CD80、CD86、MHCII分子Ia和I類分子H-2Kb。DC具有強(qiáng)烈的激活T細(xì)胞增殖的能力；1000個(gè)DC，即可有效激發(fā)T細(xì)胞增殖。LPS刺激成熟8d DC與未經(jīng)LPS刺激5d DC，其刺激同種異體或同體T細(xì)胞增殖能力明顯增高，結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且在各組中隨著DC:T比例增加，其刺激

6、T細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)LPS刺激的成熟DC分泌細(xì)胞因子IL-12p70、IL-6、TNFa和IL-1b的水平明顯升高，與未經(jīng)LPS刺激的PBS組結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.成熟DC能在DSC單層上繼續(xù)生長(zhǎng)，沒有隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而走向自然凋亡，第15d鏡下觀察形成細(xì)胞集落，發(fā)生了克隆性增殖。 結(jié)論： 1.建立的混合酶消化全組分蛻膜的方法，簡(jiǎn)化了DSC的提純程序，能獲得高純度的合乎實(shí)驗(yàn)