簡介：安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文人乳腺癌細(xì)胞侵襲相關(guān)MIRNAS的篩選及HSAMIR3395P生物學(xué)功能的初步研究姓名王艷申請學(xué)位級別碩士專業(yè)病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師胡向陽吳強(qiáng)20100301安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文4在MDAMB468和MDAMB231的表達(dá)量分別為在MCF7中表達(dá)量的028和023；（3）與對照組相比，轉(zhuǎn)染MIR3395PINHIBITS后96小時(shí)內(nèi)細(xì)胞增殖力的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）；（4）與陰性熒光RNA和空白對照組相比，轉(zhuǎn)染MIR3395PINHIBITS后MCF7細(xì)胞的侵襲力明顯增強(qiáng)（P001）；（5）MIR3395P有多個(gè)靶基因，可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡、轉(zhuǎn)錄和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種過程。結(jié)論結(jié)論（1）獲得與乳腺癌侵襲相關(guān)的MIRNA表達(dá)譜，并驗(yàn)證MIR3395P在低侵襲力乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)高于在高侵襲力乳腺癌中的表達(dá)；（2）MIR3395P不影響乳腺癌細(xì)胞的增殖活性；（3）MIR3395P對乳腺癌細(xì)胞的侵襲有抑制作用。關(guān)鍵詞乳腺癌；腫瘤侵襲；MIR3395P；MIRNA芯片；TRANSWELL

簡介：研究背景研究表明血管損傷后循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞可以通過降低內(nèi)膜增生的形成對于表面的再內(nèi)皮化過程起到一定的積極作用。建立一種有效的活體療效評價(jià)手段，即監(jiān)測移植的內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)存活、增殖、遷移和分化情況，對進(jìn)一步探討細(xì)胞移植對臟器功能改善的機(jī)制和指導(dǎo)未來細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用都具有相當(dāng)重要的意義。研究目的初步探索利用不同濃度超順磁性氧化鐵（SUPERPARAMAGICIRONOXIDE，SPIO）和多聚賴氨酸（POLYLLYSINE，PLL）特異性標(biāo)記人內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304），于體外對標(biāo)記前后的ECV304活性，增殖，凋亡，ROS、白噬性溶酶體的產(chǎn)生等情況進(jìn)行研究，探索SPIO標(biāo)記細(xì)胞的最佳條件及對內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性影響，探討SPIO示蹤標(biāo)記動脈粥樣斑塊可行性，為今后的進(jìn)一步研究工作提供技術(shù)參考。材料和方法不同濃度的超順磁性氧化鐵多聚賴氨酸復(fù)合物（SPIOPLL）特異性標(biāo)記ECV304，借助光學(xué)顯微鏡、透射電鏡、原子發(fā)射光譜儀對細(xì)胞內(nèi)的鐵和標(biāo)記效率進(jìn)行定性和定量的檢測。借助于激光共聚焦顯微鏡和活性氧（ROS）、自噬性溶酶體、線粒體膜電位（△ΨM）分子探針，體外檢測高濃度SPIO誘導(dǎo)的ROS和自噬性溶酶體的產(chǎn)生以及△ΨM的變化情況。對標(biāo)記后的ECV304使用15T磁共振成像（MRI）體外掃描。對模型動物經(jīng)靜脈注射SPIO和移植SPIO標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞對兔早期動脈粥樣硬化斑塊模型結(jié)合組織病理學(xué)進(jìn)行對照研究。結(jié)果普魯士藍(lán)染色顯示經(jīng)SPIOPLL復(fù)合物標(biāo)記ECV304后，其胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色鐵顆粒，電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，體積，細(xì)胞器無明顯變化，胞質(zhì)內(nèi)含有包裹SPIO顆粒的囊泡；計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)表明，標(biāo)記24H標(biāo)記率即達(dá)到100％；延長標(biāo)記時(shí)間并不會使細(xì)胞內(nèi)鐵含量增加；SPIOPLL復(fù)合物在50ΜGML以下時(shí)，對細(xì)胞活力無顯著影響。共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞儀的結(jié)果顯示，高于50ΜGML的SPIOPLL會使細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量增加，△ΨM下降，自噬性溶酶體數(shù)量增加，細(xì)胞凋亡有增加的趨勢，經(jīng)過LN乙酰半胱氨酸（LNAC）預(yù)處理，ROS產(chǎn)生減少，細(xì)胞凋亡率降低。在對體外標(biāo)記的細(xì)胞MRI各掃描序列中以T2WI系列上標(biāo)記前后的MR信號強(qiáng)度改變（△SI）最大且與細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。病理分析顯示外周靜脈直接注射SPIO動脈粥樣硬化模型動物的肝臟枯可細(xì)胞中有普魯士藍(lán)染色陽性顆粒；移植經(jīng)SPIO標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中，血管壁粥樣斑塊內(nèi)可見染色陽性顆粒。結(jié)論SPIOPLL體外標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞的適宜條件是25ΜGM標(biāo)記24H。濃度在50ΜGML以下時(shí)，應(yīng)用SPIOPLL復(fù)合物標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞安全、有效。ROS清除劑LNAC可以延緩或部分阻抑細(xì)胞死亡，同時(shí)SPIO誘導(dǎo)自噬性溶酶體數(shù)目增多，可以認(rèn)為高濃度SPIO誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，可能是自噬與ROS誘導(dǎo)的凋亡共同作用的結(jié)果。標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量為1105即可在MRI各序列被檢測到信號降低。

簡介：徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文NFΚB信號通路參與GDNF對多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)作用的機(jī)制研究姓名孫羽申請學(xué)位級別碩士專業(yè)神經(jīng)生物學(xué)指導(dǎo)教師高殿帥20080401徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文吐垣絲垂整簽區(qū)塑塑至照熟聳絲塑墮至望莖歪因魚拗型堡是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究T作及取得的研究成果。論文中除了特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究的啟發(fā)和所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的聲明并表示了謝意。論文使用授權(quán)聲明本人完全了解徐州醫(yī)學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和電子文檔，允許論文被查閱和借閱；學(xué)校可以公布論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存論文。保密的論文在解密后遵守此規(guī)定。作者簽名墨叢二因丑導(dǎo)師簽名

簡介：目的以家蠅抗菌肽ATTACIN為目標(biāo)基因用自行建立的家蠅胚胎細(xì)胞系MDEC07114及含有桿狀病毒穿梭載體的BAC構(gòu)建家蠅胚胎細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)對表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽ATTACIN進(jìn)行抗菌、熱穩(wěn)定性等生物學(xué)活性研究。方法1、全基因合成家蠅抗菌肽ATTACIN將目的基因ATTACIN克隆入PUC57質(zhì)粒重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后連接到PFASTBACTMHTA供體質(zhì)粒制備重組桿狀病毒BACDNA2、重組桿狀病毒BACDNA轉(zhuǎn)染家蠅胚胎細(xì)胞MDEC07114提取培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解物粗蛋白SDSPAGE檢測目的蛋白鎳柱純化粗蛋白3、SDSPAGE和WESTERNBLOT檢測、鑒定蛋白表達(dá)情況4、表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性檢測對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用經(jīng)60100℃水浴130MIN的熱穩(wěn)定性經(jīng)PH50100的酸堿作用后的耐受性。結(jié)果1、成功構(gòu)建含家蠅抗菌肽ATTACIN基因的桿狀病毒表達(dá)載體BACPFASTBACTMATTACIN2、重組桿狀病毒BACDNA成功轉(zhuǎn)染家蠅胚胎細(xì)胞細(xì)胞出現(xiàn)直徑變大、停止生長、分離等現(xiàn)象3、經(jīng)SDSPAGE檢測培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解物粗蛋白均含有分子量為24KD的目的蛋白4、鎳柱純化粗蛋白后經(jīng)SDSPAGE和WESTERNBLOT檢測證實(shí)含目的蛋白5、生物學(xué)活性檢測表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽ATTACIN可抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌活性經(jīng)60100℃水浴130MIN及PH50100酸堿作用后抗菌肽對大腸桿菌的抑菌活性影響不明顯。結(jié)論家蠅胚胎細(xì)胞MDEC07114可用于桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽ATTACIN表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽ATTACIN具有生物學(xué)活性。

簡介：分類號密級UDC編號學(xué)位論文過表達(dá)CDX2對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的初步研究THEPRELIMINARYSTUDYOFEFFECTSOFOVEREXPRESSIONOFCDX2ONBIOLOGICALBEHAVIINGASTRICCANCERCELLS儲婧指導(dǎo)教師姓名秦蓉副教授安徽醫(yī)科大基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室申請學(xué)位級別碩士專業(yè)名稱病理學(xué)與病理生理學(xué)提交論文日期20120423論文答辯日期2012年5月學(xué)位授予單位和日期安徽醫(yī)科大學(xué)基金項(xiàng)目安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號090413118）答辯委員會主席陳珂教授評閱人吳強(qiáng)教授刁路明副教授2012年5月學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名日期學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解安徽醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并向國家主管部門或其指定機(jī)構(gòu)送交論文的電子版和紙質(zhì)版，有權(quán)允許論文進(jìn)入學(xué)校圖書館被查閱，有權(quán)將學(xué)位論文的內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，有權(quán)將學(xué)位論文的標(biāo)題和摘要匯編出版。愿意將本人的學(xué)位論文提交中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫、中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫和中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫中全文發(fā)表，并可以以電子、網(wǎng)絡(luò)及其他數(shù)字媒體形式公開出版，并同意編入CNKICNKI中國知識資源總庫，在中國博碩士學(xué)位論文評價(jià)數(shù)據(jù)庫中使用和在互聯(lián)網(wǎng)上傳播。保密的學(xué)位論文在解密后適用本規(guī)定。學(xué)位論文作者簽名導(dǎo)師簽名日期日期

簡介：研究背景和目的作為身體的支撐框架骨組織在整個(gè)生命過程中不斷地受到各種力的作用而相應(yīng)地調(diào)節(jié)其質(zhì)量、密度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。成骨細(xì)胞是對應(yīng)力應(yīng)變信號進(jìn)行感知的主要力學(xué)敏感性細(xì)胞。骨缺損的修復(fù)及組織工程化骨組織的構(gòu)建成骨細(xì)胞都是在三維支架內(nèi)部貼壁生長的。支架材料作為接受外來刺激的主體將力學(xué)刺激從外部傳遞到細(xì)胞而細(xì)胞因?yàn)槭艿搅W(xué)刺激其增殖和分化的速率也將會發(fā)生改變。因此研究支架在表觀應(yīng)變下內(nèi)部的應(yīng)變分布對于研究力學(xué)刺激對三維支架內(nèi)細(xì)胞的增殖及分化具有重要的意義。MICROCT技術(shù)能夠非破壞性的獲得支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)通過這些數(shù)據(jù)進(jìn)行重建獲得支架的模型再用有限元分析不同的力學(xué)刺激下支架內(nèi)部的應(yīng)變分布。在骨移植材料和骨組織工程支架材料中羥基磷灰石HYDROXYAPATITEHA因能與骨形成很強(qiáng)的化學(xué)結(jié)合具有骨傳導(dǎo)作用而被廣泛應(yīng)用然而單一HA的脆性及低疲勞強(qiáng)度限制了其進(jìn)一步應(yīng)用殼聚糖CHITOSANCS因具有無毒性、可生物降解及良好的可加工性而被廣泛應(yīng)用于組織工程研究中將HA與CS復(fù)合從而增強(qiáng)韌性并充分發(fā)揮HA良好的生物相容性有望制備出性能優(yōu)異的骨支架材料。本研究擬制備微、納米HA并與CS共混制備復(fù)合膜及多孔支架材料考察力學(xué)刺激對MC3T3E1細(xì)胞在微、納米HACS復(fù)合膜及多孔支架上的生物學(xué)特性的影響。為骨移植材料的研制、組織工程骨的體外構(gòu)建提供一定的理論依據(jù)和新方法。研究方法1通過將豬骨脫脂脫蛋白、煅燒再球磨的方法制備微米級HA通過超聲、攪拌的方法制備納米級HA。將微、納米級HA與CS共混制備復(fù)合膜對復(fù)合膜進(jìn)行理化性能、細(xì)胞相容性測試考察MC3T3E1細(xì)胞在微、納米HACS復(fù)合膜上的增殖和凋亡優(yōu)選制備三維多孔支架材料的配比。2以石蠟微球?yàn)橹驴讋┩ㄟ^與HACS共混溶液混合后鑄模、粒子導(dǎo)出方法制備復(fù)合多孔支架材料。對制備的復(fù)合支架材料進(jìn)行動態(tài)力學(xué)性能測試及SEM形貌觀察將成骨前體細(xì)胞MC3T3E1細(xì)胞接種到支架上考察支架材料的細(xì)胞相容性對支架進(jìn)行MICROCT掃描獲得微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)并考察復(fù)合支架的體外酶解過程。3應(yīng)用MICROCT掃描得到的材料結(jié)構(gòu)參數(shù)有限元建模后分析材料在施加不同的表觀應(yīng)變時(shí)內(nèi)部的應(yīng)變分布優(yōu)選出適合的表觀應(yīng)變。對細(xì)胞支架復(fù)合物施加波形為正弦波、頻率為1HZ、表觀應(yīng)變3000ΜΕ的動態(tài)壓載荷、10MIN次1次D7D、14D后進(jìn)行相關(guān)檢測SEM觀察細(xì)胞在支架上受力后的形態(tài)變化檢測細(xì)胞增殖、凋亡ELISA檢測ALP含量REALTIMEPCR檢測BMP2、COLI、OCNMRNA表達(dá)WESTERNBLOT檢測BMP2、COLI、OCN蛋白含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1通過對松質(zhì)骨脫脂脫蛋白再煅燒、球磨的方法可以獲得粒徑較為均一的微米級天然HA粒子中值粒徑D50在121～167范圍內(nèi)。采用超聲、攪拌的方法制備了納米級的直徑約5NM、長約50NM的棒狀HA粒子。將微、納米HA與CS共混制備HACS復(fù)合膜SEM顯示HA在基質(zhì)CS中分布較均勻二者結(jié)合緊密復(fù)合膜具有較好的力學(xué)性能在CS中加入HA可以克服HA的顆粒流動性的缺點(diǎn)。比較球磨工藝及原料配比對成骨前體細(xì)胞MC3T3E1增殖及形態(tài)的影響優(yōu)選出9號復(fù)合膜的配比制備下一步的多孔支架細(xì)胞在微、納米HACS復(fù)合膜上的增殖、凋亡沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在復(fù)合膜材料上檢測細(xì)胞相容性更加直觀為下一步制備多孔支架材料提供了理論依據(jù)。2以石蠟微球?yàn)橹驴讋┩ㄟ^粒子導(dǎo)出方法制備了微、納米級HACS復(fù)合支架材料隨著致孔劑含量的增加支架的孔隙連通性增加。實(shí)驗(yàn)證實(shí)球形致孔劑制備的支架在孔隙連通性方面較立方體致孔劑更具有優(yōu)勢。對復(fù)合支架分別進(jìn)行動態(tài)力學(xué)性能測試支架表現(xiàn)出粘彈性和滯后效應(yīng)。綜合力學(xué)性能和SEM結(jié)果優(yōu)選復(fù)合溶液與石蠟微球比例為5070的支架為下一步實(shí)驗(yàn)用支架。經(jīng)MICROCT掃描后獲得的微、納米HACS復(fù)合支架的微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)基本一致將MICROCT掃描后獲得的圖像在MIMICS中建?？梢钥闯鲋苽涞闹Ъ芫哂辛己玫目紫哆B通性。微、納米HACS復(fù)合支架具有良好的細(xì)胞相容性成骨前體細(xì)胞MC3T3E1能在支架孔壁上黏附、增殖。微、納米HACS復(fù)合支架在溶菌酶的PBS溶液中可以發(fā)生降解在前4W降解速率較低在4～8W降解速率大大提高降解液中有還原糖生成且其含量隨降解時(shí)間的延長呈增大趨勢。3用基于MICROCT的有限元方法計(jì)算了不同表觀應(yīng)變下復(fù)合支架內(nèi)部的應(yīng)變分布存在應(yīng)力集中現(xiàn)象計(jì)算出應(yīng)施加的最佳表觀應(yīng)變?yōu)?000ΜΕ。對細(xì)胞支架復(fù)合物施加動態(tài)壓載荷后SEM結(jié)果表明細(xì)胞在微、納米HACS支架上可黏附、增殖7D時(shí)細(xì)胞呈梭形、不規(guī)則狀有部分集落14D細(xì)胞逐漸融合成片幾乎長滿支架表層的孔隙。REALTIMEPCR和WESTERN結(jié)果顯示COLⅠMRNA及蛋白表達(dá)在14D均高于對照組而OCN蛋白表達(dá)在7D、14D與對照組無顯著性差異表明細(xì)胞還未完全分化成熟。ALP蛋白表達(dá)在7D時(shí)明顯升高14D時(shí)又下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示基因MRNA達(dá)與蛋白表達(dá)二者間并沒有完全的一致性。結(jié)論1通過球磨法可制備微米級HA粒子通過超聲、攪拌的方法可制備出納米級HA粒子但將二者與CS共混成膜后尺度效應(yīng)不夠明顯對MC3T3E1細(xì)胞的黏附、增殖、凋亡無明顯影響可能是HA發(fā)生團(tuán)聚所致。2應(yīng)用石蠟微球做致孔劑可以得到孔隙連通性良好的微、納米HACS復(fù)合支架材料隨著致孔劑含量的增加支架的孔隙連通性增加。同法制備的微、納米HACS復(fù)合支架材料的微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)基本一致。微、納米HACS復(fù)合支架在溶菌酶的PBS溶液中可以發(fā)生降解在4～8W降解速率大大提高降解液中還原糖含量隨降解時(shí)間的延長呈增大趨勢。3應(yīng)用基于MICROCT的有限元方法可分析不同表觀應(yīng)變下復(fù)合支架內(nèi)部的應(yīng)變分布計(jì)算出利于細(xì)胞生長的最佳表觀應(yīng)變。循環(huán)壓載荷促進(jìn)了微、納米復(fù)合支架內(nèi)MC3T3E1細(xì)胞的BMP2、COLⅠ的MRNA蛋白表達(dá)但對于OCN蛋白表達(dá)無顯著影響。

簡介：本課題將以EHECO157H7STX2的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，輔以DNASTAR軟件分析，預(yù)測并篩選靶向STX2A1片段毒性活性中心的保護(hù)性B細(xì)胞表位肽，利用此肽制備靶向STX2毒性活性中心的中和性單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上制備FAB基因工程抗體，以期獲得具有臨床治療價(jià)值的中和性抗體。本研究主要分四個(gè)部分第一部分基于EHECO157H7STX2晶體結(jié)構(gòu)的B細(xì)胞表位肽的預(yù)測與免疫原性鑒定STX2保護(hù)性B細(xì)胞表位肽的預(yù)測與鑒定是利用保護(hù)性B細(xì)胞表位肽為抗原靶向性制備STX2中和性抗體的第一步。本部分研究是首先在NCBI的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫檢索EHECO157H7的STX2以及STX2與配體腺嘌呤復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)解析圖?；赟TX2與配體腺嘌呤相互作用的立體結(jié)構(gòu)，依據(jù)B表位肽的預(yù)測原則，選取STX2A1毒性片段上的4條氨基酸肽段，采用DNASTAR軟件對預(yù)測的4條氨基酸肽段進(jìn)行親水性、表面可及性、可塑性、二級結(jié)構(gòu)抗原性等參數(shù)進(jìn)行評價(jià)，通過BLAST檢索比較被預(yù)選B細(xì)胞表位肽與人、兔、鼠的同源性后，最終確定本研究所用的4條可能的B表位多肽序列，分別為PL、P2、P3、P4人工合成4條B表位肽，并且均偶聯(lián)載體蛋白鑰孔戚血藍(lán)素后分別免疫日本大耳兔，鑒定其免疫原性，間接ELISA結(jié)果顯示4條合成多肽均能刺激日本大耳兔產(chǎn)生抗多肽和天然STX2的抗體，抗血清與天然STX2反應(yīng)的效價(jià)P2P1P3P4；DOTELISA結(jié)果顯示4條B細(xì)胞表位肽制備的兔多克隆抗體能特異的與B細(xì)胞表位肽、STX2和載體蛋白KLH反應(yīng)；WESTERNBLOT結(jié)果顯示4條B細(xì)胞表位肽誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異針對STX2A亞單位的多克隆抗體，以上結(jié)果表明預(yù)測的4條多肽具有免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異的抗STX2A亞單位的抗體，確為B細(xì)胞表位肽。用4條B細(xì)胞表位肽免疫BALBC小鼠后，以天然STX2攻毒，篩選出的P1多肽為保護(hù)性B細(xì)胞表位肽，該表位肽包括STX2毒性活性位點(diǎn)即位于STX2A1片段的第77位氨基酸酪氨酸，為靶向STX2毒素活性中心的中和性單克隆抗體的研制奠定了基礎(chǔ)。第二部分基于EHECO157H7STX2B細(xì)胞表位肽的中和性MAB制備與生物學(xué)鑒定本部分研究是在第一部分成功獲得包含STX2毒性活性中心的P1保護(hù)性B細(xì)胞表位肽的基礎(chǔ)上，靶向性制備抗STX2中和性單克隆抗體，并對單抗的生物學(xué)活性進(jìn)行了鑒定。首先，以偶聯(lián)載體蛋白KLH的P1保護(hù)性B細(xì)胞表位肽為免疫原，在應(yīng)用傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用含HAT的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基和以天然STX2為篩選抗原的間接ELISA方法，快速篩選針對STX2的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。結(jié)果從1700個(gè)單克隆雜交瘤細(xì)胞中篩選出7株穩(wěn)定分泌抗天然STX2的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，染色體核型鑒定結(jié)果顯示1F2、18C3、1G1和6834株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目分別為106、100、98和104，接近小鼠脾細(xì)胞與SP20骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，說明1F2、18C3、1G1和6834株雜交瘤細(xì)胞為小鼠脾細(xì)胞與SP20細(xì)胞的融合體。而9D7、8D4和11D3的染色體數(shù)目分別140、144和142，比小鼠脾細(xì)胞與SP20骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)目的總和約多40條，與2個(gè)脾細(xì)胞與1個(gè)SP20細(xì)胞的三倍體雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目相似；DOTELISA和WESTERNBLOT鑒定結(jié)果顯示1F2、18C3、1G1、6834株單抗為STX2A亞單位特異的單克隆抗體，而8D4、11D3、9D73株單抗與KLH有交叉反應(yīng)，結(jié)合3株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目為三倍體的結(jié)果，推測其原因可能是一個(gè)單克隆細(xì)胞株融合了針對STX2和KLH兩種抗原決定簇的B淋巴細(xì)胞染色體；單克隆抗體的亞類鑒定結(jié)果顯示1F2、386、1G1和18C34株天然STX2特異的單克隆抗體均屬于IGG1Κ型1F2、386、1G1和18C34株單抗的抗體親和力常數(shù)鑒定結(jié)果分別為17109、63108、57107和9107。體外細(xì)胞毒阻斷試驗(yàn)表明1F2、18C3、1G1和6834株單克隆均有中和STX2的作用，4株單抗中和作用相比1F218C31G1683；同時(shí)高劑量的單抗具有明顯的預(yù)防保護(hù)作用；體外單克隆抗體治療保護(hù)試驗(yàn)研究顯示1F2和18C3的高劑量組有一定的治療保護(hù)作用，而且加入抗體越早中和作用越明顯，一旦毒素與細(xì)胞結(jié)合則抗體不能發(fā)揮保護(hù)作用，同時(shí)結(jié)果顯示1G1和683沒有明顯的治療保護(hù)作用，其原因可能與2株抗體的親和力較低有關(guān)。此外，P1B細(xì)胞表位肽體外競爭抑制1F2單克隆抗體對STX2毒性中和作用試驗(yàn)結(jié)果表明P1B細(xì)胞表位肽與STX2具有相同的毒性活性表位，因此本研究選用體外實(shí)驗(yàn)證明預(yù)防保護(hù)作用最強(qiáng)的1F2單抗作為動物體內(nèi)保護(hù)作用研究的對象。本部分研究表明制備的抗STX2毒性活性中心的單克隆抗體1F2具有高特異性、高親和力，在動物體內(nèi)能有效中和STX2毒素，具有良好預(yù)防和治療作用。為臨床上使用抗STX2的特異性抗體治療EHECO157H7感染，預(yù)防HUS和TTP等并發(fā)癥的出現(xiàn)，提供了可能。第三部分EHECO157H7STX2中和性FAB抗體的構(gòu)建及基因結(jié)構(gòu)分析鼠源性單克隆抗體的異源性，限制了其在臨床治療中的應(yīng)用，本部分研究采用基因工程技術(shù)將1F2中和性單抗改造成FAB基因工程抗體。首先從分泌抗STX2毒性活性中心的中和性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株1F2中提取總RNA，以提取的總RNA為模板，采用ONESTEPPTPCR試劑盒，以根據(jù)鼠免疫球蛋白不同家族的可變區(qū)基因序列設(shè)計(jì)的7對K輕鏈引物和8對IGG1重鏈FD片段引物，分別擴(kuò)增1F2抗體的K輕鏈和FD片段基因，將釣取的抗體Κ鏈和FD鏈基因構(gòu)建至FAB抗體表達(dá)載體PCOMB3X，并切除PCOMB3X載體上的噬菌體外殼蛋白III的基因后，轉(zhuǎn)化XLBLUE菌。本部分研究成功構(gòu)建了1F2FAB抗體的表達(dá)載體，基因測序結(jié)果顯示1F2FAB抗體的Κ鏈為648BP，F(xiàn)D1鏈為636BP，采用生物信息學(xué)方法對所得FAB抗體序列與現(xiàn)有已報(bào)道的其它各種抗體基因進(jìn)行同源性比較，分析其胚系基因來源，結(jié)果Κ鏈基因序列與鼠抗體的Κ鏈的胚系基因以及FD鏈基因序列和鼠抗體重鏈的胚系基因具有較高的一致性，分別為92％和87％，且和現(xiàn)有報(bào)道的各種其它已知抗體基因序列均不完全一致。說明1F2FAB抗體的基因的確來自小鼠胚系基因。根據(jù)1F2FAB抗體基因序列，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件推導(dǎo)出編碼1F2FAB抗體的FD鏈編碼212個(gè)氨基酸，分子量為2243631DA；1F2FAB抗體的Κ編碼216個(gè)氨基酸，分子量為2388252DA。將1F2FAB抗體的氨基酸序列提交SWISSMODEL在線工具，經(jīng)分子模建對其三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測并提交PDB數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果顯示1F2FAB抗體的FD鏈具有鼠FAB抗體重鏈結(jié)構(gòu)特征，可變區(qū)位于1108位氨基酸；1F2FAB抗體的Κ鏈具有鼠FAB抗體輕鏈結(jié)構(gòu)特征，可變區(qū)位于1～106位氨基酸。FD鏈的CDR1、CDR2和CDR3的區(qū)域分別為20AA～27AA、45AA～52AA和91A～100AA；Κ鏈的CDR1、CDR2和CDR3的區(qū)域分別為24AA～34AA，52AA～54AA和91AA～98AA。FD鏈氨基酸序列的第16、90、137、192、212位氨基酸和Κ鏈氨基酸序列的第21、91、137、197、216位氨基酸均為半胱氨酸，可以形成鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵。第四部分EHECO157H7STX2中和性FAB抗體的可溶表達(dá)及生物學(xué)功能研究本研究將PCOMB3X1F2FAB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化XLBLUE工程菌，30℃下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)14H，收集誘導(dǎo)后重組工程菌超聲破菌上清。間接ELLSA檢測重組工程菌超聲破菌上清，出現(xiàn)陽性結(jié)果；SDSPAGE檢測顯示在MR約為23KDA處出現(xiàn)1條新的蛋白表達(dá)帶，與1F2FABΚ鏈和FD鏈預(yù)測的分子量相近，說明重組子PCOMB31F2FABXLBLUE在IPTG的誘導(dǎo)下能分泌性表達(dá)具有與天然STX2特異結(jié)合的1F2FAB抗體，但凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析結(jié)果顯示1F2FAB抗體的表達(dá)量低，約為2％。采用PROTEINLRESIN抗體親和層析柱純化1F2FAB抗體，純化后樣品經(jīng)SDSPAGE后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析蛋白純度為95％。WESTERNBLOT結(jié)果表明，純化后的1F2FAB抗體能與相應(yīng)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上的天然STX2A亞單位蛋白在32KDA處形成單一的蛋白質(zhì)染色帶；競爭ELISA檢測結(jié)果表明，1F2FAB抗體能與親本鼠單抗1F2競爭性結(jié)合同一抗原表位，且競爭作用隨著抗體濃度增加而加強(qiáng)。根據(jù)50％抑制率時(shí)1F2FAB與親本鼠單抗1F2抗體濃度的比值，可計(jì)算出1F2FAB的親和力為親本鼠單抗1F2的85％。間接ELISA檢測結(jié)果表明，抗體的抗原結(jié)合活性隨著抗體濃度的增加而增強(qiáng)；在相同抗體濃度時(shí)，單抗1F2的結(jié)合力大于1F2FAB。綜上所述，1F2FAB和1F2兩種抗體的成功制備，為下一步分析它們的藥效研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

簡介：前言間充質(zhì)干細(xì)胞MESENCHYMALSTEMCELLS，MSCS是來源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。目前研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有多向分化、支持體外造血重建的功能，還有低免疫原性和獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特性。現(xiàn)已證實(shí)，體外培養(yǎng)擴(kuò)增的MSCS對各種免疫細(xì)胞均有免疫調(diào)節(jié)作用，而且這種作用是不受MHCMAJHISTOCOMPATIBILITYCOMPLEX限制的。低免疫原性在同種異體移植中具有重要意義，而免疫調(diào)節(jié)作用，則為免疫排斥反應(yīng)的治療帶來了新的希望。有研究表明，將MSCS與異基因造血干細(xì)胞HAEMOPOIETIESTEMCELL，HSC共輸入，可以有效地減弱移植后的免疫排斥反應(yīng)。目前實(shí)驗(yàn)及臨床研究所用的MSCS的主要來源是骨髓。另外，MSCS也可來源于脂肪、骨、肌肉、軟骨、肺臟、韌帶等。但由于數(shù)量有限，且對供者有一定的損傷，使其研究和應(yīng)用受到限制。為此，很有必要尋找新的MSCS來源。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，從胎兒出生后多作為廢物丟棄的胎盤中，可分離出一種成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，它可能含有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLS，BMSCS相似的特性。由于胎盤來源方便，對供者無損傷，且富含間充質(zhì)，如能分離出MSCS，將提供豐富的細(xì)胞來源。而目前，關(guān)于胎盤中是否含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞以及該細(xì)胞是否具有BMSCS相似的免疫調(diào)節(jié)作用，國內(nèi)的相關(guān)研究報(bào)道很少。一直以來，免疫抑制藥物在免疫排斥反應(yīng)的預(yù)防及治療中起著極為重要的作用。但是由于它們的毒副作用強(qiáng)，應(yīng)用有一定的限制性。能否利用MSCS的免疫調(diào)節(jié)特性，將MSCS與免疫抑制藥物聯(lián)合應(yīng)用于免疫排斥反應(yīng)的治療，在保證治療效果的前提下減少長期應(yīng)用藥物帶來的毒副作用，是個(gè)令人感興趣的問題。但是目前此類研究的報(bào)道很少。因此，在將它們聯(lián)合應(yīng)用于患者前，我們需要了解它們之間的相互作用。本實(shí)驗(yàn)嘗試從人胎盤中分離提取間充質(zhì)樣干細(xì)胞HUMANPLACENTADERIVEDMESENCHYMALLIKESTEMCELLSPDMSCS，對其細(xì)胞表型，增殖、分化等生物特性進(jìn)行初步了解。并將人胎盤MSCS與異基因T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，經(jīng)PHA刺激后，通過T細(xì)胞增殖的情況來測定PDMSCS對異基因T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而通過檢測T細(xì)胞在細(xì)胞周期、早期活化標(biāo)志、細(xì)胞因子的分泌、細(xì)胞亞群等方面的改變，來初步探討PDMSCS發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的可能機(jī)制。我們還將PDMSCS與免疫抑制藥物環(huán)孢素ACSA霉酚酸MPA聯(lián)合，在體外作用于單向淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)，通過檢測對淋巴細(xì)胞增殖情況的影響來初步判斷二者在異體免疫反應(yīng)中的相互作用。通過這些研究，我們期望能更加深入的了解胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及免疫學(xué)特性，為其在臨床上與免疫抑制藥物的聯(lián)合應(yīng)用，從而預(yù)防和治療免疫排斥反應(yīng)提供充足的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第一部分人胎盤來源間充質(zhì)千細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性的研究目的從胎盤中分離提取間充質(zhì)樣干細(xì)胞，并對其細(xì)胞表型、增殖、分化等生物特性進(jìn)行初步了解。方法組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行PDMSCS的分離及原代培養(yǎng)，傳代后進(jìn)行形態(tài)觀察，細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制PDMSCS的生長曲線，流式細(xì)胞技術(shù)檢測PDMSCS表型。PDMSCS向軟骨細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)，光鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)，并用甲苯胺藍(lán)染色及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后糖胺多糖及Ⅱ型膠原的表達(dá)情況。免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)后VWF的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果胎盤小塊培養(yǎng)14D后有少量長梭形細(xì)胞爬出，約25D鋪滿培養(yǎng)皿7080％，細(xì)胞呈漩渦狀生長，胞體細(xì)長似成纖維細(xì)胞。傳代后增殖速度明顯加快，約6D可鋪滿培養(yǎng)皿底80％，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)均一，連續(xù)15代后，細(xì)胞仍能維持增殖能力和典型的成纖維樣形態(tài)學(xué)特征。傳代細(xì)胞經(jīng)過約48H潛伏期后，進(jìn)入一個(gè)35天的對數(shù)生長期，隨后是一個(gè)較長的緩慢增長期。平均倍增時(shí)間約為38H。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測PDMSCS均一表達(dá)CD29，CD44，而不表達(dá)CD31，CD34CD45，HLADR。PDMSCS向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)7D后，由梭形逐漸向多角形多邊形轉(zhuǎn)變，并有多處凸起，誘導(dǎo)14D后，甲苯胺藍(lán)染色及免疫細(xì)胞化學(xué)染色均呈陽性。PDMSCS向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)4D后，少量細(xì)胞核呈橢圓形，胞體變小呈卵圓形，形態(tài)飽滿，立體感強(qiáng)。第8D12D，細(xì)胞60％90％匯合，胞體變小呈鵝卵石樣。細(xì)胞首尾緊密連接，呈管腔狀、輪輻狀、條帶狀生長。誘導(dǎo)后4D胞漿和胞核開始表達(dá)VWF。結(jié)論本研究成功地從人胎盤組織中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞PDMSCS，并證明PDMSCS有較強(qiáng)的增殖能力，具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞表型，并可在一定條件下誘導(dǎo)表達(dá)軟骨細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志，提示PDMSCS有多向分化潛能。第二部分人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對異基因T淋巴細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制的探討目的研究PDMSCS對共培養(yǎng)后異基因T淋巴細(xì)胞的影響，探討PDMSCS發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的方式及可能機(jī)制。方法將PDMSCS與PHA激活的外周血T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，MTT法檢測T細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞的周期，早期活化標(biāo)志CD25、CD69的表達(dá)情況，ANNEXINⅤ法檢測T淋巴細(xì)胞凋亡，ELISA法檢測T細(xì)胞分泌IFNΓ，IL2，IL10，IL4的水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞中CD4CD25細(xì)胞的比例。結(jié)果PDMSCS對PHA激活的外周血T淋巴細(xì)胞的增殖有抑制作用，但對其凋亡無影響。可增加T細(xì)胞中G0G1期細(xì)胞數(shù)量的比例，下調(diào)早期活化標(biāo)志CD25、CD69的表達(dá)，增加T細(xì)胞分泌IL10，IL4的水平，降低T細(xì)胞分泌IFNΓ，IL2的水平，上調(diào)CD4CD25T細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞中的比例。結(jié)論P(yáng)DMSCS在體外可抑制PHA刺激的T細(xì)胞的增殖，改變T細(xì)胞周期，抑制早期活化，改變T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的分泌是其可能機(jī)制。PDMSCS具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，在移植免疫的預(yù)防及治療中可能具有重要意義。第三部分人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞與免疫抑制藥物在單向淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)中的相互作用目的將PDMSCS與免疫抑制藥物聯(lián)合在體外作用于單向淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)，來檢測它們在異體免疫反應(yīng)中的相互作用。方法PDMSCS單獨(dú)或與免疫抑制藥物（環(huán)孢素A霉酚酸）同時(shí)在體外作用于單向淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)，MTT法檢測T細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果PDMSCS單獨(dú)在體外作用于單向淋巴細(xì)胞混合實(shí)驗(yàn)，可抑制反應(yīng)中T細(xì)胞的增殖，且呈細(xì)胞數(shù)量依賴性。與環(huán)孢素A聯(lián)合后，T細(xì)胞增殖抑制率下降，與MPA聯(lián)合后，T細(xì)胞增殖抑制率上升。結(jié)論P(yáng)DMSCS對單向淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)中T細(xì)胞的增殖有抑制作用，且呈細(xì)胞劑量依賴性。與免疫抑制藥物（環(huán)孢素A霉酚酸）聯(lián)合后，環(huán)孢素A可以減弱PDMSCS對T細(xì)胞增殖的抑制作用，霉酚酸可以增強(qiáng)PDMSCS對T細(xì)胞增殖的抑制作用。如將PDMSCS與免疫抑制藥物聯(lián)合用于預(yù)防及治療免疫排斥，免疫抑制藥物的選擇一定要慎重。

簡介：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文鈦基種植體表面仿細(xì)胞外基質(zhì)活性涂層的設(shè)計(jì)、構(gòu)建及其生物學(xué)評價(jià)姓名張鋒申請學(xué)位級別博士專業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師趙士芳李曉東20100408浙江大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要而不斷變化。以上結(jié)果證明我們所選擇的有機(jī)質(zhì)大分子被成功的組裝到了純鈦表面。接著，在各種涂層上體外培養(yǎng)成骨前體細(xì)胞MC3T3．E1，觀察細(xì)胞的粘附、增殖和分化情況。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)以I型膠原和透明質(zhì)酸為骨架的涂層最有利于成骨前體細(xì)胞的生長。接下來，我們設(shè)計(jì)合成了GRGDSPC多肽序列，并將該多肽序列引入到透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)中，然后利用自組裝的方法構(gòu)建了膠原／透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。由于該多肽序列中端基為半胱氨酸殘基，該殘基中有活潑的巰基，而巰基之間可以在溫和的條件下進(jìn)行交聯(lián)形成雙硫鍵，從而使得最后的膠原／透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合膜穩(wěn)定。這樣，我們在引入RGD序列的同時(shí)，亦實(shí)現(xiàn)了聚電復(fù)合膜的交聯(lián)。體外降解研究顯示，該交聯(lián)的膠原／透明質(zhì)酸復(fù)合膜穩(wěn)定性顯著提高；不僅如此，該涂層對谷胱甘肽具有降解響應(yīng)性，在谷胱甘肽模擬體液中的降解速度大大提高，暗示這種涂層可以在體內(nèi)通過谷胱甘肽而加速降解。體外生物學(xué)評價(jià)顯示與膠原／透明質(zhì)酸涂層相比，引入RGD的涂層顯著不僅促進(jìn)了成骨前體細(xì)胞的粘附，而且也促進(jìn)了成骨前體細(xì)胞的增殖、分化和鈣化。在此基礎(chǔ)上，我們計(jì)劃在種植體表面的涂層中引入活性生長因子。BMP．2分子由于具有強(qiáng)烈的骨誘導(dǎo)性而備受關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)也選擇BMP．2作為研究對象。首先將BMP．2溶入膠原溶液而帶上正電荷，接著通過LBL技術(shù)將BMP．2引入到涂層中，接下來同樣將涂層交聯(lián)。體外降解實(shí)驗(yàn)表明，該涂層在增加穩(wěn)定性的同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了對BMP．2分子的緩釋作用，而釋放出來的BMP．2分子也沒有喪失原有的活性。生物學(xué)評價(jià)結(jié)果也表明，與RGD功能化的膠原／透明質(zhì)酸復(fù)合膜相比，該活性涂層顯著促進(jìn)了細(xì)胞的分化和功能表達(dá)。與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能類似，該涂層不僅僅是作為成骨細(xì)胞的支架讓其黏附生長，而且涂層中的RGD序列與緩釋出來的生長因子能夠通過與整合素或其它特定的細(xì)胞表面受體與成骨細(xì)胞直接或間接的作用，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長、遷移和分化，因而具有明顯的仿生特征。不僅如此，當(dāng)以同樣的策略在已經(jīng)引入RGD的膠原／透明質(zhì)酸復(fù)合膜中組裝BFGF分子最近的研究發(fā)現(xiàn)BFGF不僅能刺激血管的再生，也能明顯促進(jìn)成骨，ITT

簡介：干細(xì)胞因其具有自我更新及多向轉(zhuǎn)化的功能，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞替代治療、基因治療及組織工程。肝衰竭是威脅人類生命的嚴(yán)重疾病，并發(fā)癥多，病死率高，治療仍是世界難題。干細(xì)胞治療在肝衰竭領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越多地受到人們的關(guān)注。目的研究慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血造血干細(xì)胞的生物學(xué)活性，及其促進(jìn)肝損傷修復(fù)、改善肝功能的可能機(jī)制進(jìn)一步探討機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改變對其功能的影響。方法本研究自慢加急性（亞急性）肝衰竭患者及健康志愿者外周血分離CD34細(xì)胞，通過觀察細(xì)胞形態(tài)、記錄細(xì)胞生長曲線、檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況，了解其生物學(xué)活性通過ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子HGF、MMP9、TNFΑ、IL6，RTPCR檢測細(xì)胞表面標(biāo)志丙酮酸激酶M2PKM2，未成熟肝細(xì)胞表面標(biāo)志、整聯(lián)蛋白Β1（INTEGRINΒ1，肝細(xì)胞發(fā)育過程中細(xì)胞表面標(biāo)志），L型丙酮酸激酶同功酶（LPK，成熟肝細(xì)胞表面標(biāo)志）的表達(dá)，免疫熒光檢測細(xì)胞表面標(biāo)志INTEGRINΒ1的表達(dá)，探究外周血CD34細(xì)胞在肝病患者體內(nèi)修復(fù)損傷肝臟的可能機(jī)制采用含慢加急性（亞急性）肝衰竭患者血漿置換前后血清的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)患者外周血CD34細(xì)胞，通過比較兩組細(xì)胞的生長曲線，及RTPCR檢測細(xì)胞表面標(biāo)志PKM2、INTEGRINΒ1，LPK的表達(dá)，免疫熒光檢測細(xì)胞表面標(biāo)志INTEGRINΒ1的表達(dá)情況，了解血漿置換后機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改善對外周血CD34細(xì)胞生物學(xué)活性的影響將熒光染料CFSE標(biāo)記的慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植入肝損傷小鼠體內(nèi)，通過觀察CFSE標(biāo)記的外周血單個(gè)核細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的遷移、在受損肝組織的定植，比較肝損傷干細(xì)胞治療組、肝損傷組及對照組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的肝組織病理改變，了解慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞歸巢及修復(fù)受損肝臟的能力。結(jié)果慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血CD34細(xì)胞體外培養(yǎng)顯示，其具有良好的生物性活性，細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡等特性較健康人外周血CD34細(xì)胞無明顯差異慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血CD34細(xì)胞可分泌HGF、MMP9、TNFΑ、IL6等可促進(jìn)肝細(xì)胞生長的細(xì)胞因子，細(xì)胞表面表達(dá)PKM2和INTEGRINΒ1，提示慢加急性（亞急性）肝衰竭時(shí)，外周血CD34細(xì)胞可能通過分泌細(xì)胞因子、以及向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)肝損傷修復(fù)，改善肝功能。含血漿置換后血清培養(yǎng)組外周血CD34細(xì)胞的增殖明顯優(yōu)于含血漿置換前血清培養(yǎng)組P＜005，提示血漿置換有利于肝衰竭患者外周血CD34細(xì)胞的增殖含血漿置換前血清培養(yǎng)組與含血漿置換后血清培養(yǎng)組均能檢測到PKM2、INTEGRINΒ1，未檢測到LPK，提示血漿置換對于外周血造血干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的能力并無明顯影響。肝損傷小鼠尾靜脈注射熒光染料CFSE標(biāo)記的慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察肝組織冰凍切片，可見熒光標(biāo)記的單個(gè)核細(xì)胞能夠遷移至受損肝組織，并定植于肝實(shí)質(zhì)內(nèi)觀察比較肝損傷干細(xì)胞治療組、肝損傷組及正常對照組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的肝組織病理，可見肝損傷干細(xì)胞治療組小鼠干細(xì)胞移植后1周，肝損傷明顯改善，隨著時(shí)間的延長，肝組織損傷逐漸修復(fù)，至第3周時(shí)已基本恢復(fù)正常。結(jié)論本研究結(jié)果表明，慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血CD34細(xì)胞具有良好的生物學(xué)活性，慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血CD34細(xì)胞還可通過旁分泌作用以及向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化的途徑，促進(jìn)肝損傷修復(fù)，改善肝功能血漿置換對肝衰竭患者機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改善有利于維持外周血CD34細(xì)胞的生物學(xué)活性，進(jìn)而發(fā)揮其更新、遷移以及分化的功能，有助于提高干細(xì)胞移植治療肝衰竭的療效。慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞在肝損傷小鼠體內(nèi)可向受損肝組織遷移、定植，進(jìn)而修復(fù)受損肝臟。

簡介：點(diǎn)擊查看更多miR-30a-5p在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向成骨細(xì)胞分化中的生物學(xué)功能驗(yàn)證.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：2碩士學(xué)位論文碩士學(xué)位論文新型人上皮性卵巢癌細(xì)胞新型人上皮性卵巢癌細(xì)胞HO8910HO8910靶向治療靶向治療系統(tǒng)的構(gòu)建及其生物學(xué)活性的體外研究系統(tǒng)的構(gòu)建及其生物學(xué)活性的體外研究THECONSTRUCTIONBIOLOGICALACTIVITYRESEARCHINVITROOFNEWHUMANOVARIANCANCEREPITHELIALCELLHO8910TARGETINGTHERAPYSYSTEM姓名姓名廖花廖花學(xué)號學(xué)號2012213410年級年級2012級院系名稱研究生院院系名稱研究生院學(xué)科專業(yè)婦產(chǎn)科學(xué)學(xué)科專業(yè)婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)老師康佳麗康佳麗教授教授導(dǎo)師單位廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院導(dǎo)師單位廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院廣州醫(yī)科大學(xué)廣州醫(yī)科大學(xué)廣州廣州2015年5月目錄目錄中文摘要中文摘要1英文摘要英文摘要4英語縮略詞一覽表英語縮略詞一覽表7前言前言8一、材料和方法一、材料和方法10二、結(jié)果二、結(jié)果24三、討論三、討論34四、結(jié)論四、結(jié)論38參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)39綜述綜述43攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文及參與科研課題攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文及參與科研課題53致謝致謝54

簡介：復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文血漿EXOSOMES生物學(xué)特征及血漿EXOSOMES對巨噬細(xì)胞功能影響的初步研究姓名李丹專業(yè)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)導(dǎo)師范華弊研究員指導(dǎo)小組成員楊潔任亞娜楊贅銘二O一一年五月復(fù)旦大學(xué)碩L學(xué)位論文中文摘要目的1研究人血漿EXOSOMES小體的生物學(xué)特征，了解血漿EXOSOMES在免疫系統(tǒng)中的作用。2通過將人血漿EXOSOMES小體與體外誘導(dǎo)分化獲得的人ML巨噬細(xì)胞共孵育，研究巨噬細(xì)胞的WNTSA通路是否被血漿EXOSOMES小體激活。方法1采用超速離心和超濾的方法分離純化血漿外泌體樣小體，從而獲得無菌的血漿外泌體樣小體。用透射電鏡觀察血漿EXOSOMES形態(tài)流式檢測血漿EXOSOMES分子表型WESTERNBLOT檢測血漿EXOSOMES的蛋白。2從健康人的外周血中分離PBMCS，然后體外培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得I型巨噬細(xì)胞。通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及流式檢測細(xì)胞表面分子確定培養(yǎng)細(xì)胞是否為巨噬細(xì)胞。將血漿外泌體樣小體與I型巨噬細(xì)胞混合培養(yǎng)后，提取巨噬細(xì)胞的RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增及電泳比較未受血漿外泌體樣小體刺激的巨噬細(xì)胞及受刺激的巨噬細(xì)胞的炎性因子基因的變化，如ILI日、IL6、TNFA、兒10。用流式檢測血漿外泌體樣小體處理巨噬細(xì)胞不同時(shí)間段胞內(nèi)CAZ‘的變化，其中以WNTSA刺激巨噬細(xì)胞胞內(nèi)CA2的變化做陽性對照組。用WESTERNBLOT方法檢測了血漿外泌體樣小體刺激的巨噬細(xì)胞CAMKH是否發(fā)生了磷酸化。結(jié)果1從健康人血漿中超速離心獲得EXOSOMES。用透射電鏡觀察小體形態(tài)，這些小體形態(tài)均一，為圓形囊泡結(jié)構(gòu)采用CD63抗體包被磁珠捕獲的血漿EXOSOMES樣小體的CD81的陽性率為7368，1783的血漿EXOSOMES樣小體表達(dá)CD86，HLA一DR陽性率為6063，血漿EXOSOMES樣小體還表達(dá)勃附相關(guān)的分子CD54和CD1IC，陽性率分別為1466和1783血漿EXOSOMES富含有CD63和CD81蛋白，而且通過實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)小體含有卜LA一DR、CDSO、CD86和WNTSA分子。2通過流式檢測發(fā)現(xiàn)EXOSOMES與巨噬細(xì)胞孵育一段時(shí)間后，巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)CA少平均熒光強(qiáng)度上調(diào)。RT一PCR檢測出EXOSOMES對巨噬細(xì)胞的促炎因子如工LL日、IL6、TNFA的表達(dá)有促進(jìn)作用，在ZH時(shí)，ILI日、TNFA基因表達(dá)達(dá)到高峰，分別比對照組上調(diào)表達(dá)055倍和169倍，而IL6基因上調(diào)表達(dá)的量在4H達(dá)到高峰，是對照組的37倍，而對抑炎因子IL10

簡介：中圖分類號BZ三Q三UDC610碩士學(xué)位論文學(xué)校代碼LQ三三三密級公玨RETRONECTIN誘導(dǎo)的DCCIK細(xì)胞生物學(xué)特性及對K562細(xì)胞殺傷活性的研究BIOLOGICALCHARACTERISTICSANDANTITUMORACTIVITYOFDCCIKCELLSINDUCEDBYRETRONECTINFORK562CELLS作者姓名學(xué)科專業(yè)研究方向?qū)W院系、所指導(dǎo)教師全玲麗臨床醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)湘雅三醫(yī)院唐雪元教授論文答辯日期醴至衫答辯委員會主席中南大學(xué)2014年5月RETRONECTIN誘導(dǎo)的DCCIK細(xì)胞生物學(xué)特性及對K562細(xì)胞殺傷活性的研究摘要目的探討重組人纖維連接蛋白RETRONECTIN，RN誘導(dǎo)的DCCIK細(xì)胞生物學(xué)特性以及對K562細(xì)胞殺傷活性的影響，以建立一種高效、簡便、殺瘤活性強(qiáng)的DCCIK細(xì)胞培養(yǎng)方法。方法通過分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)DCCIK條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得大量的DCCIK細(xì)胞，將其分為空白組、對照組和實(shí)驗(yàn)組，空白組不加入RN和DCCIK條件培養(yǎng)基PBMCS組，對照組不加入RNDCCIK組，實(shí)驗(yàn)組加入RNRNDCCIK組，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞動態(tài)增殖情況及細(xì)胞形態(tài)變化，采用流式細(xì)胞儀檢測其免疫表型，ANNEXINVFITC檢測細(xì)胞的凋亡情況。應(yīng)用CCK一8試劑盒分別檢測兩組細(xì)胞在不同效靶比時(shí)對K562細(xì)胞的殺傷活性，采用酶聯(lián)免疫法ELISA檢測K562／DCCIK組、K562／RNDCCIK組細(xì)胞IFN小ILL8分泌水平。采用實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)IMPCR檢測細(xì)胞中MIRNA21表達(dá)情況。結(jié)果1RNDCCIK組細(xì)胞生長增殖速度顯著快于DCCIK組2倍～35倍，從第7天到第14天，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005。DCCIK組細(xì)胞凋亡率為544土111％，RNDCCIK組細(xì)胞凋亡率為181土046％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義PO05。2隨著效靶比的增加，各組效應(yīng)細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷活性也增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義儼005；同一效靶比下，RNDCCIK組細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷率高于DCCIK組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義FP005。3K562／RNDCCIK組細(xì)胞IFN一1，分泌量顯著高于K562／DCCIK組，K562／DCCIK組細(xì)胞IL18分泌量較K562／RNDCCIK組高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義FP005。4經(jīng)QRTPCR檢測分析可知，與對照組相比，K562／RNDCCIK組細(xì)胞MIRNA2L表達(dá)顯著低于K562／DCCIK組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義尸005。結(jié)論1用RETRONECTIN誘導(dǎo)可提高DCCIK細(xì)胞的增殖速度及抗腫瘤的能力。2用RETRONECTIN誘導(dǎo)可阻斷MIRNA21的表達(dá)，可能為II

簡介：南方醫(yī)科大學(xué)2010級碩士學(xué)位論文沉默維生素D結(jié)合蛋白基因?qū)Π螂装㏕24細(xì)胞生物學(xué)特性的影響STUDIESOFTHEINFLUENCEOFT24BLADDERCANCERCELL’SBIOLOGICABET晦VIORBYSILENCINGTHEVITAMINEDBINDINGPROTEINGENE課題來源自選學(xué)位申請人陳定南導(dǎo)師姓名譚萬龍教授專業(yè)名稱泌尿外科培養(yǎng)類型臨床型培養(yǎng)層次碩士研究生所在學(xué)院南方醫(yī)院2013年3月20日廣州摘要的表達(dá)，特別是蛋白的表達(dá)，因而調(diào)控DNA的功能，在腫瘤的形成過程中越來越受到重視【L引。雖然在醫(yī)學(xué)上的提高和監(jiān)測膀胱癌的早期檢出率仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。而我們最近研究發(fā)現(xiàn)，維生素D結(jié)合蛋白VITAMINDBINDINGPROTEIN，又稱為DBP或GC蛋白，以下簡稱GC蛋白可以作為一個(gè)新的尿源性標(biāo)志物16J，在早期的膀胱尿路上皮癌的檢測和監(jiān)測中發(fā)揮重要的作用，并有可能成為將來早期診斷膀胱癌的重要方法。但維生素D結(jié)合蛋白在膀胱移行上皮癌細(xì)胞中的作用尚未被闡明，所以有必要對該蛋白在膀胱癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用作進(jìn)一步的研究和探討。實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)旨在1研究GC蛋白在膀胱癌T24細(xì)胞株與正常膀胱粘膜上皮細(xì)胞中表達(dá)的差異；2通過RNAI干擾的方法，沉默膀胱癌T24細(xì)胞GC基因，下調(diào)膀胱癌T24細(xì)胞GC蛋白的表達(dá)，并進(jìn)一步研究其對膀胱癌T24細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法第一部分1細(xì)胞培養(yǎng)選取膀胱癌T24細(xì)胞株及正常膀胱粘膜上皮細(xì)胞作為對照組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分為膀胱癌細(xì)胞組和正常膀胱粘膜上皮細(xì)胞組。2分別對兩組細(xì)胞提取總蛋白，應(yīng)用免疫印跡法，經(jīng)過蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉雜交及曝光檢測GC蛋白在膀胱癌T24細(xì)胞株中的表達(dá)與該蛋白在正常膀胱粘膜上皮細(xì)胞株中表達(dá)的差異。第二部分1細(xì)胞培養(yǎng)選取膀胱癌T24細(xì)胞株分為GCSIRNA組作為實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、空白對照組共三組，其中GCSIRNA組應(yīng)用RNAI的方法，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SIRNA干擾片段，沉默膀胱癌T24細(xì)胞維生素D結(jié)合蛋白基因簡稱GC基因的表達(dá)；陰性對照組用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染陰性對照片段，不干擾GC基因的表達(dá)；空白對照組則不作轉(zhuǎn)染處理。2分別用熒光電鏡觀察GCSIRNA組及