毛囊干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞生物學(xué)特性的比較研究.pdf

1、目的：
　　1、建立高效、快速的兔FSCs(Folliclestemcells，F(xiàn)SCs)和ESCs(Epidermalstemcells，ESCs)分離、培養(yǎng)技術(shù)，進(jìn)行原代與傳代細(xì)胞的培養(yǎng)。2、觀察體外培養(yǎng)的兔FSCs和ESCs生物學(xué)特征、細(xì)胞周期，并比較兩種細(xì)胞的差異。3、體外分離、培養(yǎng)人FSCs和ESCs，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。4、比較人FSCs和ESCs生物學(xué)特征。探討更合適組織工程皮膚的種子細(xì)胞，為體外構(gòu)建含有附屬器官的人工皮

2、膚和實(shí)現(xiàn)大面積皮膚損傷從結(jié)構(gòu)修復(fù)到功能重建提供基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、采用兩步酶消化法從兔觸須部和腹部皮膚分別獲取FSCs和ESCs，進(jìn)行原代與傳代培養(yǎng)，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　2、免疫組化檢測(cè)兔FSCs和ESCs的表面標(biāo)記物，β1整合素和角蛋白19(keratin19，K19)的表達(dá)差異。用MTT法考察FSCs和ESCs增殖活性。
　　3、采用流式細(xì)胞儀分析兔的第5代和第15代FSCs和ESCs

3、各周期細(xì)胞的分布；比較經(jīng)傳代后兩種細(xì)胞的生物學(xué)活性。
　　4、用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)傳代培養(yǎng)的FSCs和ESCsK19，β1整合素在：mRNA水平上的表達(dá)差異。
　　5、采用單細(xì)胞法和組織塊法培養(yǎng)，分離培養(yǎng)人頭皮來(lái)源的FSCs；分離培養(yǎng)人皮膚的ESCs，進(jìn)行原代和傳代細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。
　　6、比較人FSCs和ESCs體外貼壁時(shí)間、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞增殖活性的差異。
　　結(jié)果：
　　1、采用兩步酶

4、法成功地分離出兔的FSCs和ESCs，F(xiàn)SCs分離培養(yǎng)2天開(kāi)始有細(xì)胞貼壁，3天時(shí)貼壁的細(xì)胞有明顯的聚集傾向，7天后克隆增大開(kāi)始融合，傳代培養(yǎng)的FSCs貼壁迅速，細(xì)胞培養(yǎng)8天達(dá)到完全融合。ESCs培養(yǎng)10天細(xì)胞才有克隆樣生長(zhǎng)趨勢(shì)；傳代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁緩慢，細(xì)胞培養(yǎng)2周80％融合。
　　2、免疫組化染色結(jié)果顯示，兔FSCs和ESCsβ1整合素、K19免疫染色均陽(yáng)性表達(dá)。FSCs和ESCs生長(zhǎng)曲線的比較除第2天無(wú)明顯的差異外，從第6天開(kāi)始F

5、SCs的增殖活性明顯高于ESCs，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第10、14、18天FSCs的增殖活性逐漸增強(qiáng)，直到第26天，增殖活性開(kāi)始下降；ESCs在第10天達(dá)到了增殖最高峰后細(xì)胞增殖活性迅速下降。FSCs顯示出持續(xù)高增殖，其高增殖時(shí)間是ESCs的2倍。
　　3、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示，傳代培養(yǎng)的FSCs和ESCs隨代次延長(zhǎng)S期百分比和PI值均有下降，同代次細(xì)胞FSCsPI值大于ESCs。
　　4、熒光定量PC

6、R檢測(cè)兔FSCs和ESCs的β1整合素和K19基因表達(dá)，顯示FSCsβ1整合素和K19mRNA表達(dá)明顯高于ESCs。
　　5、“兩步酶”分離法可獲取大量人FSCs和ESCs；單細(xì)胞培養(yǎng)FSCs細(xì)胞大部分在24h內(nèi)貼壁，傳代細(xì)胞增殖迅速，3天左右達(dá)到80％以上融合。組織塊培養(yǎng)5天可見(jiàn)細(xì)胞在組織周?chē)莱?，?xì)胞呈表皮樣。生長(zhǎng)迅速，15天時(shí)可見(jiàn)表皮樣細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)成纖維樣的細(xì)胞。ESCs培養(yǎng)3天時(shí)細(xì)胞多懸浮生長(zhǎng)。傳代細(xì)胞增殖緩慢，培養(yǎng)7天細(xì)

7、胞達(dá)到80％融合。
　　6、人FSCs和ESCsβ1整合素、K19免疫染色均陽(yáng)性。FSCs與ESCs生長(zhǎng)曲線相比，F(xiàn)SCs具有更高的增殖活性且有一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)高增殖活性的生長(zhǎng)期。
　　結(jié)論：
　　1、“兩步酶”消化法是一種安全、高效的FSCs和ESCs的分離方法?？稍谳^短時(shí)間內(nèi)為實(shí)驗(yàn)研究提供大量目標(biāo)細(xì)胞。
　　2、人和兔來(lái)源的FSCs與ESCs均表達(dá)表皮干細(xì)胞標(biāo)志β1整合素和K19，且FSCs顯示高表達(dá)。