自噬在大鼠脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 自噬在大鼠脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)
　　研究目的:建立大鼠脊髓損傷模型，觀察自噬在脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱不同時(shí)間點(diǎn)膀胱逼尿肌中的表達(dá)。
　　研究方法:36只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為脊髓損傷組和假手術(shù)組。對照組只接受T10-T11水平的椎板切除術(shù)，而不損傷脊膜;實(shí)驗(yàn)組大鼠采用改良的Allen's法進(jìn)行脊髓損傷的手術(shù)。兩組均在術(shù)后1天、4天和14天進(jìn)行運(yùn)動(dòng)評

2、分和膀胱功能評估。在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組都隨機(jī)選出6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被處死，取材。使用BBB功能評定量表評定大鼠的運(yùn)動(dòng)功能情況;使用膀胱殘余尿量和膀胱功能評分評估大鼠膀胱功能;Western blotting檢測大鼠膀胱組織中的LC3蛋白表達(dá);應(yīng)用免疫熒光法檢測自噬相關(guān)指標(biāo)LC3、P62，觀察其陽性細(xì)胞表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR對大鼠膀胱組織檢測自噬活動(dòng)相關(guān)基因LC3、P62 mRNA水平。
　　研究結(jié)果:實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷組大鼠術(shù)后

3、雙下肢功能喪失，并拖地行走，但是從術(shù)后1天開始，大鼠下肢功能逐漸恢復(fù)。脊髓損傷組大鼠術(shù)后膀胱功能出現(xiàn)障礙，但是隨著時(shí)間逐漸有所恢復(fù)。Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，脊髓損傷組大鼠逼尿肌LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著增高(P＜0.01)，而且在術(shù)后4天達(dá)到最高值。免疫熒光染色結(jié)果顯示在術(shù)后1天、4天、14天，脊髓損傷組逼尿肌LC3-Ⅱ的表達(dá)較假手術(shù)組明顯在增加(P＜0.05)。同時(shí)，術(shù)后1天，脊髓損傷組逼尿肌P62有表達(dá)，但是術(shù)

4、后4天較假手術(shù)組表達(dá)減少，并持續(xù)到術(shù)后14天。RT-PCR結(jié)果顯示，在術(shù)后1天、4天、14天脊髓損傷組逼尿肌LC3mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加，結(jié)果顯示在術(shù)后4天，術(shù)后4天脊髓損傷組大鼠膀胱逼尿肌LC3mRNA的表達(dá)較術(shù)后1天明顯增加，但是術(shù)后14天脊髓損傷組大鼠膀胱逼尿肌LC3mRNA的表達(dá)較術(shù)后4天有所減少;RT-PCR結(jié)果顯示，術(shù)后1天，脊髓損傷組大鼠膀胱逼尿肌P62mRNA表達(dá)與假手術(shù)組相比無明顯差別;術(shù)后4天和術(shù)后14天，脊

5、髓損傷組大鼠膀胱逼尿肌P62mRNA表達(dá)與假手術(shù)組相比明顯減少，但是，術(shù)后14天脊髓損傷組大鼠膀胱逼尿肌P62mRNA表達(dá)較術(shù)后4天有所增加。
　　研究結(jié)論:脊髓損傷后膀胱逼尿肌中自噬被激活，并持續(xù)相當(dāng)長的一段時(shí)間;自噬的表達(dá)與膀胱功能和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)相一致，提示自噬可能參與膀胱和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù);自噬可能在神經(jīng)源性膀胱發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮一定的作用，并可能參與膀胱逼尿肌的自我修復(fù)。
　　第二部分 3-MA通過抑制自噬反應(yīng)對大鼠

6、脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的作用研究
　　研究目的:通過自噬抑制劑3-MA的干預(yù)，觀察對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的影響及膀胱逼尿肌細(xì)胞中自噬的表達(dá)。
　　研究方法:27只雄性wistar大鼠隨機(jī)分為空白對照組，脊髓損傷組和3-MA注射組?？瞻讓φ战M只接受T10-T11水平的椎板切除術(shù)，而不損傷脊膜;脊髓損傷組和3-MA注射組大鼠采用改良的Allen's法進(jìn)行脊髓損傷的手術(shù)，造模完成后，3-MA注射組大鼠腹腔注射3-MA(2mg

7、/kg)，脊髓損傷組和空白對照組注射同等劑量的生理鹽水。在術(shù)后1天、4天、14天進(jìn)行運(yùn)動(dòng)評分、殘余尿量、膀胱功能評分，在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組都隨機(jī)選出3只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被處死，取材。使用BBB功能評定量表評定大鼠的運(yùn)動(dòng)功能情況;使用膀胱殘余尿量和膀胱功能評分評估大鼠膀胱功能;Western blotting檢測大鼠膀胱組織中的LC3蛋白表達(dá);應(yīng)用免疫熒光法檢測自噬相關(guān)指標(biāo)LC3、P62，觀察其陽性細(xì)胞表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR對大鼠膀胱組織

8、檢測自噬活動(dòng)相關(guān)基因LC3mRNA、P62mRNA水平。
　　研究結(jié)果:造模后，脊髓損傷組和3-MA注射組的下肢基本沒有運(yùn)動(dòng)功能，而假手術(shù)組的大鼠運(yùn)動(dòng)功能沒有受損。與脊髓損傷組相比，3-MA注射組的BBB評分降低，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。從術(shù)后1天至術(shù)后14天，脊髓損傷組和3-MA注射組的膀胱殘余尿量逐漸減少，特別是術(shù)后3天至術(shù)后9天。但是，3-MA注射組的殘余尿量相比脊髓損傷組增加，差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

9、3-MA注射組術(shù)后比脊髓損傷組在術(shù)后1天、9天、12天、14天的膀胱功能評分降低，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示在術(shù)后1天、4天、14天3-MA注射組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)較脊髓損傷組均有所降低，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示在術(shù)后1天、4天、14天，3-MA注射組膀胱逼尿肌LC3 mRNA的表達(dá)比脊髓損傷組均有所降低，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在術(shù)后4天、14天，3-MA

10、注射組膀胱逼尿肌P62 mRNA的表達(dá)比脊髓損傷組均有所升高，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。免疫熒光染色結(jié)果顯示在術(shù)后1天、4天、14天3-MA注射組LC3蛋白的陽性細(xì)胞率比脊髓損傷組均有所降低，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在術(shù)后1天、4天、14天3-MA注射組P62蛋白的陽性細(xì)胞率比脊髓損傷組均有所升高，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:腹腔內(nèi)注射自噬抑制劑3-MA抑制了脊髓損傷后大鼠膀胱逼尿肌自噬的表

11、達(dá)，對膀胱功能的恢復(fù)和下肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)產(chǎn)生影響，抑制了功能的恢復(fù);進(jìn)一步證實(shí)自噬可能參與脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的自我修復(fù)，對于膀胱逼尿肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。
　　第三部分 自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的作用研究
　　研究目的:觀察自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的影響。
　　研究方法:15只雄性wistar大鼠隨機(jī)分為空白對照組，脊髓損傷組和雷帕霉素注射組?？瞻讓φ战M只接受T10-T

12、11水平的椎板切除術(shù)，而不損傷脊膜;脊髓損傷組和雷帕霉素注射組大鼠采用改良的Allen's法進(jìn)行脊髓損傷的手術(shù)，造模完成后，雷帕霉素注射組大鼠腹腔注射雷帕霉素(2mg/kg)，脊髓損傷組和空白對照組注射同等劑量的生理鹽水。在術(shù)后1天、3天、5天、7天、9天、11天、14天進(jìn)行運(yùn)動(dòng)評分、殘余尿量、膀胱功能評分。使用BBB功能評定量表評定大鼠的運(yùn)動(dòng)功能情況;使用膀胱殘余尿量和膀胱功能評分評估大鼠膀胱功能。
　　研究結(jié)果:造模后，脊髓損

13、傷組和雷帕霉素注射組的下肢功能喪失，而假手術(shù)組大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能正常。術(shù)后1天開始，脊髓損傷組和雷帕霉素注射組的下肢功能逐漸恢復(fù)，隨時(shí)間呈上升趨勢。其中，在術(shù)后3天、5天、9天雷帕霉素注射組的BBB評分較脊髓損傷組升高，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在術(shù)后11天、14天差距有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在術(shù)后7天、9天、11天、14天，雷帕霉素注射組的殘余尿量相比脊髓損傷組減少，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在術(shù)后1，3，5，