硫化氫激活EcDOS及其化學(xué)修飾血紅素機(jī)制研究.pdf

1、大腸桿菌氧感應(yīng)蛋白(Direct Oxygen Sensor from E.coli,EcDOS)是大腸桿菌c-di-GMP細(xì)胞信號(hào)通路中的重要調(diào)控蛋白。其c-di-dGMP催化活性使其具有代謝信號(hào)分子的功能。研究發(fā)現(xiàn)該蛋白的催化活性能被氧氣激活,后又有發(fā)現(xiàn)證實(shí)氣體信號(hào)分子NO,CO同樣具有激活其酶活性的作用。最近的研究已檢測(cè)到另一新的氣體信號(hào)分子,H2S也具有激活EcDOS活性的作用,但其僅對(duì)Fe3+血紅素的EcDOS有作用,而NO和

2、CO僅作用于Fe2+血紅素的EcDOS。而且,H2S對(duì)EcDOS的激活具有氧依賴性,即無(wú)氧環(huán)境下H2S的激活作用遠(yuǎn)小于有氧環(huán)境。這暗示著,H2S與EcDOS血紅素的反應(yīng)機(jī)理同NO或CO并不相同,或許更為復(fù)雜。
　　本文將詳述綜合運(yùn)用光譜學(xué)和質(zhì)譜學(xué)分析手段探究H2S作用機(jī)理的全部細(xì)節(jié)。本研究利用定點(diǎn)突變技術(shù)將EcDOS血紅素結(jié)合域(調(diào)控結(jié)構(gòu)域)—EcDOS-PAS上兩個(gè)最重要的血紅素互作位點(diǎn)M95、R97進(jìn)行突變。利用光譜學(xué)比較突變

3、后的蛋白其與H2S的反應(yīng)有何不同?光譜學(xué)結(jié)果證實(shí)這兩個(gè)位點(diǎn)都是蛋白質(zhì)中與H2S相互作用的位點(diǎn),而R97則是更為重要的直接作用位點(diǎn)。R97的突變導(dǎo)致蛋白與H2S的反應(yīng)能力喪失,且蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性受到影響。具體表現(xiàn)為,R97位點(diǎn)突變導(dǎo)致血紅素結(jié)合部位空間構(gòu)象改變(預(yù)測(cè)),導(dǎo)致H2S與EcDOS反應(yīng)過(guò)程中,產(chǎn)生大量活性氧(H2O2為主,實(shí)驗(yàn)證實(shí))。過(guò)氧化氫的產(chǎn)生使得血紅素極易被氧化,從而進(jìn)一步產(chǎn)生血紅素的共價(jià)修飾,生成verdoheme。這一發(fā)

4、現(xiàn)對(duì)于理解蛋白-血紅素相互作用提供了新的參考。
　　綜上,本文的主體部分將展示以下幾點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的全部方法和證據(jù)及論證過(guò)程:
　　(1)采用鎳親和層析柱(GE Histrap-HP)可一步純化制備Ec DOS野生型及其突變蛋白,牛血清來(lái)源的凝血酶(Sigma)可準(zhǔn)確切割6-組氨酸標(biāo)簽,為EcDOS的相關(guān)研究提供合格的蛋白樣品。
　　(2)Met95和Arg97都是EcDOS與血紅素上結(jié)合的配體相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn),其改變使得H

5、2S與血紅素的結(jié)合受到不同程度的影響。R97是更為重要的直接作用位點(diǎn),突變這一位點(diǎn)會(huì)完全改變H2S與血紅素的結(jié)合以及產(chǎn)生新的反應(yīng)。
　　(3)R97A和R97I這兩個(gè)突變型表現(xiàn)出不同于野生型和其他突變蛋白的反應(yīng)特性,這樣的突變可能導(dǎo)致蛋白構(gòu)象的顯著改變。
　　(4)血紅素加氧酶代謝血紅素的第一步產(chǎn)物加氧血紅素和副產(chǎn)物一氧化碳在R97A和R97I這兩個(gè)突變蛋白與H2S的反應(yīng)中被檢測(cè)到。中間產(chǎn)物過(guò)氧化氫也被證實(shí)在反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生。