硫化氫影響全長EcDOS磷酸二酯酶活性的機制研究.pdf

1、大腸桿菌直接氧感應(yīng)蛋白（Direct Oxygen Sensor from E.coli，EcDOS or DosP）是一種含有血紅素的氧氣感應(yīng)磷酸二酯酶，一旦其N端的感受結(jié)構(gòu)域血紅素復(fù)合物與氧氣結(jié)合，C端催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)就會改變，進而激活其磷酸二酯酶活性，加速催化大腸桿菌體內(nèi)一種重要第二信使c-di-GMP降解為l-di-GMP，從而調(diào)控磷酸化、離子結(jié)合、氣體結(jié)合、DNA結(jié)合、運動性、毒性、細(xì)胞間信號傳導(dǎo)以及生物膜形成等重要生物學(xué)功能

2、。最近已有研究證實有氧條件下，硫化氫也可以增加EcDOS對c-di-GMP的磷酸二酯酶活性，但是具體機制尚不清楚。
　　本研究主要探索有氧條件下硫化氫增加野生型全長EcDOS磷酸二酯酶活性的機制。利用EcDOS調(diào)控結(jié)構(gòu)域上兩個重要位點Met95和Arg97突變得到的六個突變體來輔助分析上述機制。研究中結(jié)構(gòu)分析主要運用島津雙波長分光光度計進行，光譜學(xué)結(jié)果顯示，加入硫化氫后，野生型和六個突變體光譜均有改變，即硫化氫對其均有作用。此后，

3、我們又分別利用比色法和高效液相色譜法探究加入硫化氫之后酶活性的變化，從而了解EcDOS結(jié)構(gòu)變化與功能的關(guān)系，并進一步推斷有氧條件下野生型EcDOS與硫化氫反應(yīng)的機制。
　　因此，本文將主要涉及以下方法：（1）使用鎳親和層析柱（GE Health care，Histrap-HP）從超聲破碎的菌液中分離純化出全長EcDOS野生型以及突變型蛋白，并用SDS-PAGE驗證其純度，保證樣品滿足實驗要求。（2）應(yīng)用商品化的磷酸鹽定量試劑盒Bi

4、omol Green配合酶標(biāo)儀間接測得酶活性，并將加硫化氫和未加硫化氫的酶活性進行對比分析，同時比較硫化氫對不同突變體酶活性的影響，分析Met95和Arg97兩個重要位點的作用。（3）用高效液相色譜法測定酶促反應(yīng)之后反應(yīng)液中底物和產(chǎn)物的濃度，從而得到酶活性數(shù)據(jù)，并與Biomol Green方法得到的數(shù)據(jù)比對，互相印證結(jié)果。
　　通過以上實驗，本研究得到以下結(jié)論：（1）Met95和Arg97是EcDOS與血紅素上結(jié)合的配體相互作用的

5、關(guān)鍵位點，突變之后將顯著影響EcDOS的結(jié)構(gòu)與功能，影響其與氣體信號分子硫化氫的結(jié)合，尤其是R97A和R97I中血紅素修飾物的產(chǎn)生提示其構(gòu)象的改變，而這一改變將影響其活性。（2）光譜結(jié)果顯示W(wǎng)T（野生型）和Met95突變體有Fe(III)-SH heme和Fe(II)-O2復(fù)合物形成，WT和M95H形成Fe(III)-SH復(fù)合物，進一步被還原為Fe(II)-O2復(fù)合物，M95A和M95L形成的Fe(III)-SH復(fù)合物沒有發(fā)生進一步的還

6、原，而Arg97突變體中R97A和R97I形成血紅素修飾物verdoheme，R97E形成一個新的復(fù)合物Fe(II)，這是目前發(fā)現(xiàn)的第一個可以分離的沒有結(jié)合氧氣或其他外來配體的復(fù)合物（3）兩種酶活性測定方法獲得的酶活性數(shù)據(jù)顯示，實驗條件下，硫化氫可以增加WT和M95突變體的酶活性，對R97突變體的酶活性沒有顯著性影響。以上結(jié)果顯示，有氧條件下，在硫化氫與全長 EcDOS作用過程中，F(xiàn)e(III)-SH heme和Fe(II)-O2復(fù)合物