TLR2-TLR4活化相關(guān)微小RNA對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞造血支持功能的調(diào)控作用.pdf

1、背景和目的：
　　間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種多能干細(xì)胞，具有高度自我更新和分化潛能，多種組織、器官均可分離提取出MSCs。其中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）是MSCs最豐富的來(lái)源，且易于獲取。Toll樣受體（TLRs）是參與天然免疫和獲得性免疫的一類重要蛋白分子。MicroRNA（miRNA）是一類具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA，大小約19-23個(gè)核苷酸，主要在轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)和證實(shí)m

2、iRNA參與MSCs的增殖、分化、遷移、生存以及旁分泌等一系列生理和病理過(guò)程，并在調(diào)控MSCs的造血支持療效上起了重要作用。目前，多種細(xì)胞類型中已證實(shí)：TLR信號(hào)可調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)，反之miRNA又可作為重要的調(diào)節(jié)分子調(diào)控TLR信號(hào)。因此有理由考慮TLR活化相關(guān)的miRNA參與調(diào)控了MSCs的多種功能。本課題組前期工作證實(shí)TLR2及TLR4表達(dá)于BM-MSCs，并且可以調(diào)節(jié)其遷移、分化等多種生物學(xué)功能。進(jìn)一步采用高通量測(cè)序的方法測(cè)定

3、分析了Pam3CSK4（TLR2激動(dòng)劑）或LPS（TLR4激動(dòng)劑）刺激后BM-MSCs的miRNA表達(dá)譜變化，并根據(jù)miRNA表達(dá)譜的變化，我們選擇了TLR活化明顯相關(guān)的4種miRNA：高表達(dá)的miR-146a、miR-214，以及表達(dá)顯著下調(diào)的miR-323b、miR-425。觀察上述4種miRNAs對(duì)BM-MSCs遷移能力的影響，同時(shí)研究他們對(duì)BM-MSCs誘導(dǎo)造血干細(xì)胞遷移與分化的影響。
　　方法：
　　分離培養(yǎng)健康志

4、愿者的BM-MSCs，分別用miR-214、miR-146a、miR-323b和miR-425的類似物（miRNA mimic）或抑制劑（miRNA inhibitor）通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染第三代細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)各組細(xì)胞中相應(yīng)miRNA的表達(dá)量。用趨化實(shí)驗(yàn)觀察各組貼壁細(xì)胞的遷移能力及各組 MSCs培養(yǎng)上清對(duì)人臍帶血CD34+細(xì)胞的遷移能力的影響，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）定量檢測(cè)培養(yǎng)上清中趨化因子SDF-1的分泌水

5、平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BM-MSCs表面趨化因子受體4（CXCR4）的表達(dá)情況。構(gòu)建BM-MSCs與臍血CD34+細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，2周后，通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)造血干細(xì)胞的分化情況，ELISA定量檢測(cè)培養(yǎng)上清中造血生長(zhǎng)因子IL-1β、IL-8、G-CSF的分泌水平。
　　結(jié)果：
　　1.用miR-214、miR-146a、miR-323b和miR-425類似物或抑制劑分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，四種 miRNA表達(dá)量均出現(xiàn)相應(yīng)變化。與對(duì)照

6、組相比，轉(zhuǎn)染 miR-214、miR-146a、miR-323b和miR-425類似物后，相應(yīng)的miRNA表達(dá)顯著上調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-214、miR-146a、miR-323b和miR-425抑制劑后，相應(yīng)的miRNA表達(dá)顯著下調(diào)。
　　2.miR-323b類似物轉(zhuǎn)染的BM-MSCs的遷移能力受抑，而其抑制物組遷移力明顯增高。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)比較處理后細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)情況，miR-323b類似物組CXCR4表達(dá)量減低。

7、　　3.在CD34+細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，較之空白對(duì)照，BM-MSCs的培養(yǎng)上清明顯促進(jìn)CD34+細(xì)胞遷移；與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、陰性對(duì)照組（NC組）相比，miR-214類似物組BM-MSCs培養(yǎng)上清明顯促進(jìn)CD34+細(xì)胞的遷移，而miR-214抑制物組表現(xiàn)為抑制CD34+細(xì)胞的遷移。ELISA檢測(cè)各組的SDF-1濃度無(wú)明顯差異。
　　4.將各組細(xì)胞與CD34+細(xì)胞共培養(yǎng)兩周后，CD34+細(xì)胞的分化趨勢(shì)有差異，其中miR-425表達(dá)上調(diào)的BM

8、-MSCs可明顯誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞向髓系分化。
　　5.BM-MSCs的培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-8、G-CSF分泌水平變化情況：miR-425類似物組G-CSF的分泌量明顯高于對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　1.miR-323抑制了BM-MSCs遷移能力，可能與BM-MSCs表面CXCR4表達(dá)受抑有關(guān)。
　　2.高表達(dá)miR-214的BM-MSCs培養(yǎng)上清可促進(jìn)CD34+細(xì)胞的遷移，其原因與SDF-1無(wú)明顯相關(guān)性。