TLR2及TLR4活化對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞造血支持功能的影響.pdf

1、背景和目的:Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類天然免疫受體,在激活天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要的作用。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stromal cells,MSC)是一種具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。最近研究表明Toll樣受體(toll-like receptors)可表達(dá)于MSC表面,并且可以調(diào)節(jié)其免疫調(diào)節(jié)、遷移、損傷組織修復(fù)等多種生物學(xué)功能。作為造血微

2、環(huán)境的主要組成細(xì)胞,MSC參與造血生成,但迄今為止,TLR受體對(duì)MSC造血支持功能的調(diào)控尚不清楚。本文將研究TLR2及TLR4對(duì)MSC造血支持功能的影響,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　方法:應(yīng)用Ficoll法體外分離培養(yǎng)健康供者的骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC),流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面CD14、CD34、CD31、CD45、HLA-DR、CD90、CD105、CD166、CD29、CD44、CD13及CD73

3、的表達(dá),并利用體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BM-MSC的成脂及成骨分化能力,鑒定MSC。RT-PCR分析BM-MSC內(nèi)TLR1-10的表達(dá),同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析其表面TLR2及TLR4的表達(dá)水平。利用TLR2激動(dòng)劑(PAM3CSK4)或(和)TLR4激動(dòng)劑(LPS)刺激BM-MSC,MACS磁珠分選系統(tǒng)分離出新鮮臍血的CD34+造血干祖細(xì)胞,將分選的CD34+與BM-MSC共培養(yǎng),收集不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞,進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)和有核細(xì)胞計(jì)數(shù),并利

4、用流式細(xì)胞術(shù)分析擴(kuò)增后細(xì)胞的多種分化指標(biāo)(CD3、CD19、Gly-a、CD41a、CD13、CD11b、CD11c、CD14)的表達(dá)情況;了解TLR2或(和)TLR4的活化對(duì)BM-MSC支持CD34+造血干祖細(xì)胞增殖和分化的影響。同時(shí)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)PAM3CSK4或(和) LPS活化BM-MSC不同時(shí)間后,多種相關(guān)造血生長(zhǎng)因子(IL-1、IL-3、IL-8、IL-11、G-CSF、GM-CSF、SCF、M-CSF

5、及EPO)分泌水平的變化。
　　結(jié)果:流式結(jié)果顯示BM-MSC表達(dá)CD90、CD105、CD166、CD29、CD44、CD13及CD73,不表達(dá)CD14、CD34、CD31、CD45及HLA-DR,BM-MSC能夠體外誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞;RT-PCR分析表明在 mRNA水平,BM-MSC表達(dá)TLR1-6,不表達(dá)TLR7-10,流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)其表面有TLR2及TLR4的表達(dá);在給予PAM3CSK4或LPS短暫刺激B

6、M-MSC24小時(shí)后,能夠顯著增強(qiáng)CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力;擴(kuò)增后細(xì)胞進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,對(duì)照組的總集落(CFU-total),粒系集落形成單位(CFU-G)、爆發(fā)式紅系形成單位(BFU-E)、巨噬系集落形成單位(CFU-M)、混合系集落形成單位(CFU-GEMM)分別為:(66.0±5.9)、(43.5±5.5)、(3.0±2.4)、(15.0±4.4)及(4.5±1.1)。對(duì)照組PAM3CSK4及LPS組的總集落(CFU-to

7、tal),粒系集落形成單位(CFU-G),爆發(fā)式紅系形成單位(BFU-E)較對(duì)照組明顯增加;隨后的表型分析顯示,與對(duì)照組相比,PAM3CSK4及 LPS組的 CD13表達(dá)水平對(duì)照組明顯增加,同時(shí)PAM3CSK4的Gly-a較對(duì)照組明顯增加,進(jìn)一步對(duì)其它髓系標(biāo)志(CD11b、CD11c、CD14)研究顯示,PAM3CSK4及LPS組較對(duì)照組均明顯增加。BM-MSC在給予PAM3CSK4或(和)LPS活化后,BM-MSC不同時(shí)間后除IL-3