人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞TLR4信號(hào)通路及與BV-2細(xì)胞共培養(yǎng)研究.pdf

1、研究背景:
　　 新生兒腦損傷目前尚無及時(shí)有效治療手段，MSCs是目前最有希望的治療新生兒腦損傷的細(xì)胞治療手段。但有關(guān)MSCs治療腦損傷仍處于研究階段。
　　 目的:
　　 體外分離、鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hWJ-MSCs)，觀察hWJ-MSCs在體外的擴(kuò)增效率、不同擴(kuò)增代數(shù)之間的生長(zhǎng)差異，觀察hWJ-MSCs在體外模擬炎性環(huán)境下的生物學(xué)表型改變，并將hWJ-MSCs與中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的免疫細(xì)胞-神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞

2、在炎癥模型環(huán)境下進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察兩種細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究MSCs的顱內(nèi)移植治療提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 為以上目的，本研究分為以下3部分。
　　 1.hWJ-MSCs的分離、體外擴(kuò)增及鑒定
　　 收集北京軍區(qū)總醫(yī)院正常足月剖宮產(chǎn)新生兒臍帶組織5根。所有臍帶組織在離體后立即放置入無菌環(huán)境保存，并在1-6 h內(nèi)處理完畢以保證分離細(xì)胞活力。臍帶組織在無菌環(huán)境下剔除臍動(dòng)、靜脈，物理方法剪

3、碎，隨后用胰酶+膠原酶-Ⅱ聯(lián)合消化法及貼壁法分離純化并體外擴(kuò)增hWJ-MSCs。采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)hWJ-MSCs細(xì)胞表面標(biāo)記CD14、CD31、CD73、CD105、CD90、HLA-ABC、HLA-DR鑒定。并采用體外成軟骨、成脂肪分化試劑盒觀察細(xì)胞分化潛力。將兩種分離方法所得細(xì)胞分別傳代，觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞周期變化。
　　 2.觀察toll-like receptor4(TLRs)在hWJ-MSCs上的表達(dá)及其信號(hào)通路對(duì)hW

4、J-MSCs生物學(xué)功能的影響
　　 采用流式細(xì)胞術(shù)及qRT-PCR方法檢測(cè)TLR4在hWJ-MSCs上的表達(dá)情況。采用TLR4激活劑-LPS體外刺激hWJ-MSCs，在LPS刺激不同時(shí)間點(diǎn)觀察hWJ-MSCs細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞增殖及生長(zhǎng)周期變化。收集不同LPS刺激時(shí)間(24h、48h、72h)后的hWJ-MSCs細(xì)胞，采用trizol試劑提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYRB Green試劑盒檢測(cè)hWJ-MSCs的細(xì)胞因子(I

5、L-1β、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、indoleamine2,3-dioxygenase[IDO]-1、TNF-α、IFN-γ、MMP-2和MMP-9)在LPS刺激條件下的表達(dá)改變情況。收集細(xì)胞同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，觀察細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平差異，進(jìn)一步確認(rèn)qRT-PCR結(jié)果。
　　 3.hWJ-MSCs與小鼠源小膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞系BV-2體外共培養(yǎng)研究
　　 將體

6、外分離所得的hWJ-MSCs與BV-2細(xì)胞在體外按不同比例進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)體系在LPS+/LPS-下不同時(shí)間點(diǎn)兩種細(xì)胞各自的生物學(xué)變化。采用qRT-PCR檢測(cè)共培養(yǎng)條件下hWJ-MSCs表達(dá)IL-1β、IL-6、IL-8及MMP-2差異;同時(shí)檢測(cè)BV-2細(xì)胞M2細(xì)胞表型基因Arginase1、Arginase2、Mrc1和Ym1的表達(dá)改變，觀察BV-2選擇性激活（M2型）標(biāo)記是否受到hWJ-MSCs的影響。使用NO檢測(cè)試

7、劑盒檢測(cè)共培養(yǎng)體系中BV-2細(xì)胞NO分泌差異，觀察直接接觸共培養(yǎng)時(shí)hWJ-MSCs對(duì)LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功分離并鑒定hWJ-MSCs
　　 臍帶組織在無菌條件下經(jīng)剪成碎片貼壁培養(yǎng)皿生長(zhǎng)或進(jìn)一步消化獲得單細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)瓶，均可見長(zhǎng)梭形類似成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增純化，體外最多可成功擴(kuò)增至20代。在20代之前細(xì)胞細(xì)胞可保持原代生長(zhǎng)形態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面

8、標(biāo)記結(jié)果顯示所得細(xì)胞CD14、CD31、HLA-DR陰性， CD73、CD105、CD90、HLA-ABC陽性，體外分化實(shí)驗(yàn)提示所得細(xì)胞體外誘導(dǎo)成軟骨、成脂肪分化成功。依據(jù)貼壁生長(zhǎng)形態(tài)、細(xì)胞表面標(biāo)記及分化潛力，符合國(guó)際細(xì)胞療法協(xié)會(huì)有關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞的定義。提示采用貼壁法、胰酶-膠原酶聯(lián)合消化法均成功獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。所得細(xì)胞在3-7代間經(jīng)PI染色法觀察細(xì)胞周期，細(xì)胞均處于G0/G1期，極少數(shù)細(xì)胞處于增殖分裂期，具有干細(xì)胞特性。未見死亡

9、、晚期凋亡細(xì)胞。
　　 2.鑒定TLR4為hWJ-MSCs表面的功能性受體
　　 流式細(xì)胞術(shù)和qRT-PCR分析揭示TLR4在hWJ-MSCs上的表達(dá)。LPS體外刺激hWJ-MSCs成功引發(fā)細(xì)胞應(yīng)激性反應(yīng)，檢測(cè)TLR4信號(hào)通路相關(guān)炎性因子(IL-1β、IL-1α、IL-6、IL-8)基因表達(dá)差異，提示所檢測(cè)炎性因子基因均在刺激72h后表達(dá)明顯上調(diào)，但I(xiàn)L-12在LPS刺激條件后均表現(xiàn)為明顯的下調(diào)，未檢測(cè)到IL-2、IL-

10、4、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ的表達(dá)。對(duì)MMP-2和MMP-9基因表達(dá)情況的檢測(cè)提示MMP-2在LPS刺激后72h出現(xiàn)明顯上調(diào)，但MMP-9表達(dá)在LPS刺激后出現(xiàn)短暫(48h)的下調(diào)，但在72h后，MMP-9表達(dá)上升至與陰性對(duì)照大致持平的水平。此外，MSC免疫抑制分子IDO1、IDO-2、IFN-β和Cox2基因表達(dá)情況的檢測(cè)結(jié)果顯示:IDO1和IFN-β在LPS刺激條件下出現(xiàn)明顯上調(diào)，IDO1表達(dá)上調(diào)在72h內(nèi)上調(diào)

11、呈現(xiàn)為雙峰，在48h檢測(cè)表達(dá)為低谷。Cox2的表達(dá)同樣受到LPS的誘導(dǎo)，但僅在LPS刺激72h后出現(xiàn)明顯的上調(diào);此外，在我們觀察的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)IDO-2表達(dá)變化。該結(jié)果顯示LPS可修飾hWJ-MSCs的免疫抑制功能。
　　 3.hWJ-MSCs與BV-2體外共培養(yǎng)時(shí)的相互調(diào)節(jié)作用
　　 在體外共培養(yǎng)條件下，hWJ-MSCs和BV-2兩種細(xì)胞均為貼壁生長(zhǎng)。在LPS刺激條件下，hWJ-MSCs可顯著減弱LPS對(duì)BV-2的

12、刺激作用;與hWJ-MSCs共培養(yǎng)時(shí):如無LPS刺激，BV-2僅分泌極低量的NO;但LPS刺激條件下，hWJ-MSCs對(duì)BV-2分泌NO有明顯的抑制作用，且與細(xì)胞共培養(yǎng)比例有關(guān);qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn):當(dāng)兩種細(xì)胞比例維持在1∶1時(shí)，hWJ-MSCs可明顯上調(diào)BV-2細(xì)胞的M2細(xì)胞表型標(biāo)記Arginase1表達(dá);BV-2與hWJ-MSCs共培養(yǎng)條件下，hWJ-MSCs表達(dá)IL-1β、IL-1α、IL-6、IL-8和MMP-2明顯受到LPS

13、、BV-2細(xì)胞以及共培養(yǎng)細(xì)胞比例三種因素的影響:其中IL-1β表達(dá)表現(xiàn)為僅受到LPS的影響(LPS-上調(diào)，LPS+抑制);MMP-2僅在LPS-共培養(yǎng)72h后出現(xiàn)上調(diào)，其他情況下均表現(xiàn)為抑制狀態(tài);IL-6僅在LPS+共培養(yǎng)24h內(nèi)上調(diào)，其他時(shí)間、環(huán)境下均表現(xiàn)為下調(diào);而IL-8的表達(dá)影響主要與時(shí)間有關(guān)，在共培養(yǎng)24h內(nèi)(LPS-/LPS+)均表現(xiàn)為上調(diào)，而在其他時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)為下調(diào)。與共培養(yǎng)中BV-2細(xì)胞相比，hWJ-MSCs受到的調(diào)節(jié)更為復(fù)

14、雜，與多種環(huán)境因素有關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.貼壁法以及胰酶-膠原酶Ⅱ聯(lián)合消化法均能成功分離hWJ-MSCs，體外標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，可體外傳代20代，提示hWJ-MSCs為有限傳代的MSCs;
　　 2.基因及蛋白水平檢測(cè)提示MSCs表達(dá)TLR4，經(jīng)LPS體外刺激模型試驗(yàn)進(jìn)一步提示TLR4在hWJ-MSCs為一功能性受體，但與其他成體組織來源MSCs比較，hWJ-MSCs對(duì)LPS的刺激反應(yīng)顯遲鈍，需要LPS刺激