研究BMP-2對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:生存在骨髓微環(huán)境即微龕(niche)中的造血干細(xì)胞(HSCs)為所有成熟血細(xì)胞的原始造血細(xì)胞，其具有高度自我更新能力與多向分化潛能。微龕極其復(fù)雜，由基質(zhì)細(xì)胞及其前體間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)等組成，它們對(duì)于HSC生理功能的調(diào)控起著重要的作用。niche主要分為“成骨微龕”和“血管微龕”，前者主要維持HSC靜息狀態(tài)，后者可以調(diào)節(jié)HSC增殖、分化、遷移等。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)超家

2、族中的一員，是一個(gè)多功能蛋白，作為重要的成骨因子可刺激MSC分化為成骨細(xì)胞，構(gòu)成“成骨niche”的主體結(jié)構(gòu)，此外它還能促進(jìn)血管的形成，關(guān)于它在成骨niche中的研究較多，而其在血管niche方面的作用研究較少。BMP-2在造血調(diào)控中也起重要作用，關(guān)于其在胚胎期造血中的研究較多，而其在成人造血中的作用研究得較少。目前關(guān)于MSC促進(jìn)HSC增殖的研究較多，而關(guān)于BMP-2對(duì)MSC促進(jìn)HSC增殖的影響的研究較少。本研究通過(guò)transwell非

3、接觸共培養(yǎng)CD34+細(xì)胞與MSC，并用BMP-2干預(yù)，在第三天時(shí)檢測(cè)HSC的增殖指標(biāo)，可以了解MSC和BMP-2對(duì)CD34+細(xì)胞增殖的影響以及BMP-2信號(hào)通路對(duì)MSC促進(jìn)HSC增殖的影響。這能為骨髓CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增的深入研究提供依據(jù)，同時(shí)為我們下一步探討相關(guān)機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，且這有利于造血干細(xì)胞移植(HSCT)的發(fā)展及惡性血液病的治療。
　　方法:①結(jié)合MSCs貼壁生長(zhǎng)的特性采用全骨髓法體外擴(kuò)增成人BMMSCs至P3，并

4、用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)鑒定MSCs的表面標(biāo)志及純度;②通過(guò)密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)，再用miniMACS磁珠分選儀從MNCs中分選成人骨髓CD34+細(xì)胞，并用FCM鑒定其純度;③利用Transwell小室(微網(wǎng)孔徑0.4um)非接觸共培養(yǎng)骨髓CD34+細(xì)胞與P3代的BMMSCs，并用BMP-2干預(yù)，具體分組為:單純HSC組、HSC+BMP2組、HSC+MSC組、HSC+MSC+BMP2組。培養(yǎng)至72小時(shí)收集樣本;④用

5、以下方法檢測(cè)HSC在不同組的增殖情況:計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每組HSC的四個(gè)復(fù)孔的數(shù)目;TRIZOL法提取各組HSC的RNA后測(cè)定RNA濃度并計(jì)算各組HSC的RNA的含量;實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組HSC的增殖基因Ki67的mRNA水平的表達(dá)，PCR的Ct值利用2-△△Ct分析法進(jìn)行相對(duì)定量(RQ)分析;⑤統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法:所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用單因素方差分析，均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）”表示，當(dāng)P

6、＜0.05時(shí)差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:①全骨髓法培養(yǎng)的BMMSCs成梭形，貼壁生長(zhǎng)，排列成旋渦狀;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示傳至第3代的BMMSCs高表達(dá)CD105，而CD45、CD34陰性表達(dá)，MSCs的純度為52.4％。②miniMACS磁珠分選出了較高純度的CD34+細(xì)胞，純度為81.9％。③各組HSC的計(jì)數(shù)（×104個(gè)）:共培養(yǎng)組(3.03±0.50)、HSC+BMP2組(1.70±0.51)均高于HSC單純培養(yǎng)組（1

7、.2±0.43）;共培養(yǎng)+BMP2組(5.29±0.20)高于共培養(yǎng)組(3.03±0.50);P值均＜0.05。④各組HSC的RNA量（RNA濃度的單位為ng/ul，總RNA還需×50ul）:HSC+BMP2組（138±3.464）及共培養(yǎng)組(163±3.559)高于HSC單純培養(yǎng)組(113±2.944);共培養(yǎng)+BMP2組（241±3.651）高于共培養(yǎng)組（163±3.559）;P值均＜0.05。⑤熒光定量PCR法檢測(cè)HSC的Ki67

8、的mRNA相對(duì)表達(dá)量，即RQ值:共培養(yǎng)組(3.27±0.08)及HSC+BMP2組(2.44±0.26)高于HSC單純培養(yǎng)組（1.00±0.13）;共培養(yǎng)+BMP2組(5.08±0.20)高于共培養(yǎng)組(3.27±0.08);P值均＜0.05。
　　結(jié)論:①利用全骨髓法成功培養(yǎng)出MSC;②應(yīng)用免疫磁珠分選法成功分選出HSC;③BMP-2可以促進(jìn)HSC增殖;④MSC可以促進(jìn)HSC增殖;⑤MSC與BMP-2具有協(xié)同效應(yīng)，即BMP-2信號(hào)