研究BMP-2對骨髓間充質干細胞促進造血干細胞增殖的影響.pdf

1、目的:生存在骨髓微環(huán)境即微龕(niche)中的造血干細胞(HSCs)為所有成熟血細胞的原始造血細胞，其具有高度自我更新能力與多向分化潛能。微龕極其復雜，由基質細胞及其前體間充質干細胞(MSCs)、細胞因子、細胞外基質等組成，它們對于HSC生理功能的調控起著重要的作用。niche主要分為“成骨微龕”和“血管微龕”，前者主要維持HSC靜息狀態(tài)，后者可以調節(jié)HSC增殖、分化、遷移等。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2是轉化生長因子(TGF-β)超家

2、族中的一員，是一個多功能蛋白，作為重要的成骨因子可刺激MSC分化為成骨細胞，構成“成骨niche”的主體結構，此外它還能促進血管的形成，關于它在成骨niche中的研究較多，而其在血管niche方面的作用研究較少。BMP-2在造血調控中也起重要作用，關于其在胚胎期造血中的研究較多，而其在成人造血中的作用研究得較少。目前關于MSC促進HSC增殖的研究較多，而關于BMP-2對MSC促進HSC增殖的影響的研究較少。本研究通過transwell非

3、接觸共培養(yǎng)CD34+細胞與MSC，并用BMP-2干預，在第三天時檢測HSC的增殖指標，可以了解MSC和BMP-2對CD34+細胞增殖的影響以及BMP-2信號通路對MSC促進HSC增殖的影響。這能為骨髓CD34+細胞體外擴增的深入研究提供依據(jù)，同時為我們下一步探討相關機制的研究奠定基礎，且這有利于造血干細胞移植(HSCT)的發(fā)展及惡性血液病的治療。
　　方法:①結合MSCs貼壁生長的特性采用全骨髓法體外擴增成人BMMSCs至P3，并

4、用流式細胞術(FCM)鑒定MSCs的表面標志及純度;②通過密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞(MNCs)，再用miniMACS磁珠分選儀從MNCs中分選成人骨髓CD34+細胞，并用FCM鑒定其純度;③利用Transwell小室(微網(wǎng)孔徑0.4um)非接觸共培養(yǎng)骨髓CD34+細胞與P3代的BMMSCs，并用BMP-2干預，具體分組為:單純HSC組、HSC+BMP2組、HSC+MSC組、HSC+MSC+BMP2組。培養(yǎng)至72小時收集樣本;④用

5、以下方法檢測HSC在不同組的增殖情況:計數(shù)板計數(shù)每組HSC的四個復孔的數(shù)目;TRIZOL法提取各組HSC的RNA后測定RNA濃度并計算各組HSC的RNA的含量;實時熒光定量PCR法檢測各組HSC的增殖基因Ki67的mRNA水平的表達，PCR的Ct值利用2-△△Ct分析法進行相對定量(RQ)分析;⑤統(tǒng)計學分析方法:所有統(tǒng)計學數(shù)據(jù)均用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較用單因素方差分析，均以“均數(shù)±標準差（(X)±SD）”表示，當P

6、＜0.05時差異被認為具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:①全骨髓法培養(yǎng)的BMMSCs成梭形，貼壁生長，排列成旋渦狀;流式細胞術檢測顯示傳至第3代的BMMSCs高表達CD105，而CD45、CD34陰性表達，MSCs的純度為52.4％。②miniMACS磁珠分選出了較高純度的CD34+細胞，純度為81.9％。③各組HSC的計數(shù)（×104個）:共培養(yǎng)組(3.03±0.50)、HSC+BMP2組(1.70±0.51)均高于HSC單純培養(yǎng)組（1

7、.2±0.43）;共培養(yǎng)+BMP2組(5.29±0.20)高于共培養(yǎng)組(3.03±0.50);P值均＜0.05。④各組HSC的RNA量（RNA濃度的單位為ng/ul，總RNA還需×50ul）:HSC+BMP2組（138±3.464）及共培養(yǎng)組(163±3.559)高于HSC單純培養(yǎng)組(113±2.944);共培養(yǎng)+BMP2組（241±3.651）高于共培養(yǎng)組（163±3.559）;P值均＜0.05。⑤熒光定量PCR法檢測HSC的Ki67

8、的mRNA相對表達量，即RQ值:共培養(yǎng)組(3.27±0.08)及HSC+BMP2組(2.44±0.26)高于HSC單純培養(yǎng)組（1.00±0.13）;共培養(yǎng)+BMP2組(5.08±0.20)高于共培養(yǎng)組(3.27±0.08);P值均＜0.05。
　　結論:①利用全骨髓法成功培養(yǎng)出MSC;②應用免疫磁珠分選法成功分選出HSC;③BMP-2可以促進HSC增殖;④MSC可以促進HSC增殖;⑤MSC與BMP-2具有協(xié)同效應，即BMP-2信號